羊種布魯氏菌外膜蛋白Omp31對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的影響及其分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：構(gòu)建布魯氏菌外膜蛋白Omp31的原核重組質(zhì)粒pET-30a-omp31，表達(dá)并純化Omp31融合蛋白，通過(guò)檢測(cè)Omp31融合蛋白刺激小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞后細(xì)胞因子TNF-α、IL-6及HMGB1的分泌情況及TLR4 mRNA的表達(dá)情況，初步探討布魯氏菌外膜蛋白Omp31在引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中所起的作用及 HMGB1/TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是否介導(dǎo)參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的病理過(guò)程，并探討Omp31融合蛋白對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響。
　

2、　方法：從 Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得布魯氏桿菌外膜蛋白Omp31的全基因序列，設(shè)計(jì)引物，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增出Omp31蛋白的基因序列，通過(guò)基因克隆技術(shù)構(gòu)建Omp31基因的原核表達(dá)載體pET-30a-omp31，表達(dá)、純化布魯氏桿菌Omp31融合蛋白，并用不同濃度的 Omp31融合蛋白刺激小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組，然后用ELISA方法測(cè)定促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6及HMGB1的分泌情況；利用流式細(xì)胞儀分析其對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞凋

3、亡的影響；用RT-qPCR測(cè)定TLR4基因水平的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。多組均數(shù)間的比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：經(jīng)過(guò)雙酶切及測(cè)序驗(yàn)證證明成功構(gòu)建了 Omp31基因的原核表達(dá)載體pET-30a-omp31。通過(guò)對(duì)原核重組質(zhì)粒 pET-30a-omp31進(jìn)行蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化得到了Omp31融合蛋白，其融合蛋白的分子量為31kDa左右。將不同濃度的Omp31蛋白刺激小膠質(zhì)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)該蛋白能誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞

4、表達(dá)和分泌細(xì)胞因子TNF-α，IL-6及 HMGB1，其中幾乎各組TNF-α，IL-6的分泌量均高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，1.0ug/ml組、2.5ug/ml組及5.0ug/ml組引起的HMGB1的分泌量同空白對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其蛋白濃度在2.5ug/ml時(shí)TNF-α及HMGB1的表達(dá)量最高，蛋白濃度在5.0ug/ml時(shí)IL-6的表達(dá)量最高，之后隨著蛋白濃度的增加細(xì)胞因子的分泌量逐漸下降。在

5、小膠質(zhì)細(xì)胞中有TLR4 mRNA的表達(dá)，其表達(dá)量隨蛋白濃度不同呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì)，0.5ug/ml組、1.0ug/ml組、2.5ug/ml組及5.0ug/ml組較空白對(duì)照組相比均明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Omp31融合蛋白能夠抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡。
　　結(jié)論：同空白對(duì)照組相比，Omp31融合蛋白刺激組的 HMGB1分泌量及 TLR4 mRNA的表達(dá)量明顯上升，同時(shí)TNF-α、IL-6的表達(dá)