鴨坦布蘇病毒對小鼠的分子致病機(jī)制.pdf

1、2010年4月，最先在我國南方地區(qū)爆發(fā)了一種以蛋鴨產(chǎn)蛋量急劇下降、采食量減少、生長遲緩甚至死亡為特征的新發(fā)病毒性疾病，給蛋鴨飼養(yǎng)業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。幾個實(shí)驗(yàn)室相繼分離鑒定出引起該病的病原體。核苷酸序列分析表明該病原體為黃病毒科（Flaviviridae）黃病毒屬（Flavivirus）恩塔亞病毒群（Ntaya virus group）的鴨坦布蘇病毒(Duck Tembusu virus，DTMUV)。黃病毒屬的其它大部分成員能夠引起嚴(yán)

2、重的人畜共患性傳染病，因此，到目前為止我們尚不能排除DTMUV感染人類的可能性。為了研究DTMUV對哺乳動物的致病性，本研究以BABL/c小鼠為實(shí)驗(yàn)動物模型，以DTMUVFX2010株為代表株，將該病毒通過腦內(nèi)直接接種方式傳25代、然后經(jīng)鼻腔接種繼續(xù)傳代至28代。通過比較FX2010、P7、P14、P21和P28對小鼠的致病性發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)X2010鼻腔攻毒不感染小鼠，而P7、P14、P21和P28均能夠通過鼻腔接種致死小鼠。
　　

3、為了進(jìn)一步研究DTMUV與其傳代毒株對小鼠和鴨的致病性，本研究根據(jù)DTMUV的E基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)了特異反轉(zhuǎn)錄引物、核酸探針和擴(kuò)增引物，建立了一種定量組織中的DTMUV含量的TaqMan熒光定量PCR方法。之后，分別選擇不同攻毒劑量和不同攻毒方式進(jìn)行致病性研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)X2010、P7和P28通過肌肉注射方式感染小鼠均不致死，也無任何明顯癥狀;通過鼻腔接種小鼠其致病力卻顯著不同，103 ELD50的P7和P28病毒能夠致死小鼠，而10

4、5 ELD50的FX2010不能使小鼠死亡。本研究應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)一步監(jiān)測了FX2010、P7、P28病毒通過鼻腔接種小鼠后，在小鼠臟器內(nèi)的增值情況，結(jié)果顯示，F(xiàn)X2010、P7和P28都能在小鼠的鼻和肺內(nèi)增殖，但前者病毒含量高于后者;三者都不感染小鼠的脾臟和腎臟;FX2010不能在小鼠的腦內(nèi)復(fù)制，而P7和P28能夠感染小鼠腦且病毒含量較高。鴨子實(shí)驗(yàn)證明，F(xiàn)X2010和P28都能引起鴨的全身性感染，它們對鴨的致病力差異不顯著。通

5、過對全基因組序列比較發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)X2010與P7之間只有兩個氨基酸位點(diǎn)突變(E蛋白上的E597K和NS3蛋白上的A2001T)，F(xiàn)X2010和P28之間有12個核苷酸位點(diǎn)突變，導(dǎo)致6個氨基酸位點(diǎn)突變。結(jié)果表明E蛋白上的E597K和NS3蛋白上的A2001T在DTMUV對小鼠致病性增強(qiáng)中起到了關(guān)鍵作用。
　　 為研究DTMUV傳代毒由鼻腔進(jìn)入腦組織的擴(kuò)散路徑，本研究利用5％ ZnSO4溶液，通過灌鼻破壞小鼠的嗅上皮，然后用P7病毒經(jīng)鼻