口服雷帕霉素抑制mTOR對(duì)防止支架內(nèi)再狹窄作用的分子機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、冠心病(coronaryheartdisease，CHD)嚴(yán)重威脅現(xiàn)代人的健康，帶來(lái)沉重的社會(huì)公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)。根據(jù)世界衛(wèi)生組織2006年公布的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，在全世界15-60歲人群的死因中，腦卒中和冠心病分列第五和第二位。根據(jù)我國(guó)衛(wèi)生部公布的數(shù)據(jù)，2005年中國(guó)城市居民冠心病死亡率為46.3/10萬(wàn)。冠心病的病因尚不完全清楚，研究顯示冠心病為多種危險(xiǎn)因素作用所致，包括血脂異常、男性、年齡、高血壓病、糖尿病、肥胖、體力活動(dòng)減少、吸煙、家族史等。

2、冠心病的癥狀常出現(xiàn)于40歲以上的中老年人，致死性心肌梗死的患者中約80％是65歲以上的老年人。目前冠心病的治療主要包括藥物治療、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(Percutaneouscoronaryintervention，PCI)和冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)(Coronaryarterybypassgrafting，CABG)。PCI術(shù)于世紀(jì)七十年代末首次應(yīng)用于臨床，1984年，我國(guó)成功進(jìn)行了第一例PTCA術(shù)，經(jīng)過(guò)近幾十年的發(fā)展，PCI術(shù)由最初的單純

3、球囊擴(kuò)張發(fā)展到后來(lái)的裸金屬支架(Barementalstent，BMS)植入，直至現(xiàn)今被廣泛應(yīng)用的藥物洗脫支架(Drugeluntingstent，DES)，隨著技術(shù)的進(jìn)步與新設(shè)備、新器械的不斷問(wèn)世，PCI術(shù)現(xiàn)已成為冠心病治療中較為成熟的手段之一。
　　 多中心隨機(jī)臨床試驗(yàn)已證實(shí):冠狀動(dòng)脈藥物洗脫支架能顯著減少內(nèi)膜增生和再狹窄發(fā)生率（術(shù)后5年內(nèi)約9％～10％），改善癥狀，提高生活質(zhì)量。盡管藥物涂層支架(DES)的廣泛應(yīng)用顯著降低

4、了PCI術(shù)后再狹窄的發(fā)生，但是其卻增加了支架相關(guān)血栓的發(fā)生率，如雷帕霉素涂層支架，在抑制血管平滑肌細(xì)胞增生的同時(shí)也造成了植入支架的內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)延遲，容易形成血栓。同時(shí)，所有接受DES植入的患者需要接受至少12個(gè)月的雙聯(lián)抗血小板治療，增加了術(shù)后出血的風(fēng)險(xiǎn)。
　　 mTOR是哺乳類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。研究發(fā)現(xiàn)，mTOR通路激活參與了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展，與炎癥反應(yīng)、脂代謝紊亂存在協(xié)同作用。mTOR信號(hào)通路調(diào)

5、控異常與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生密切相關(guān)，而傳統(tǒng)的mTOR抑制劑主要是雷帕霉素及其衍生物，雷帕霉素能抑制與單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞有關(guān)的細(xì)胞因子的產(chǎn)生，包括MCP-1與IL-6。Suzuki等發(fā)現(xiàn)雷帕霉素能有效減低MCP-1mRNA水平。Basso等發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用雷帕霉素具有獨(dú)立于降低膽固醇影響之外的抑制動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程的作用。
　　 血管內(nèi)超聲成像技術(shù)(IVUS)是近幾年發(fā)展起來(lái)的新型影像學(xué)技術(shù)，在冠脈介入手術(shù)中的價(jià)值已日益顯著，由于其能精確

6、的顯示粥樣硬化斑塊的性質(zhì)及血管壁的圖像，能夠準(zhǔn)確判斷支架貼壁與否以及支架后再狹窄的情況，已成為冠心病診斷與治療中的重要輔助手段之一，在認(rèn)識(shí)到口服雷帕霉素對(duì)斑塊的積極作用后，我們希望借助血管內(nèi)超聲技術(shù)，評(píng)估口服雷帕霉素配合金屬裸支架治療減少再狹窄的效果。
　　 同時(shí)，在組織學(xué)及病理學(xué)方面，我們應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)、透射電鏡技術(shù)、檢測(cè)了靶血管組織的α-actin，mTOR，膠原，脂質(zhì)等各項(xiàng)指標(biāo)，以探求BMS植入加口服雷帕霉素能否達(dá)到

7、與DES植入類(lèi)似的效果，若此法可行，那么將為經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療術(shù)提供一種全新的方案，在預(yù)防支架內(nèi)在狹窄的同時(shí)，還可以降低支架內(nèi)血栓發(fā)生率，并減少術(shù)后雙聯(lián)抗血小板治療的時(shí)間，同時(shí)降低晚期支架內(nèi)血栓的發(fā)生率。
　　 研究目的:
　　 (1)建立AS動(dòng)物模型;
　　 (2)通過(guò)血管內(nèi)超聲觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腹主動(dòng)脈粥樣硬化板塊形態(tài)并于特定位置行支架植入術(shù);
　　 (3)測(cè)定模型動(dòng)物干預(yù)前后血生化各項(xiàng)指標(biāo);
　　

8、 (4)聯(lián)合應(yīng)用血管內(nèi)超聲(IVUS)、病理學(xué)及免疫組織化學(xué)技術(shù)，探明口服雷帕霉素抑制支架內(nèi)再狹窄的作用及其分子機(jī)制;
　　 (5)觀察金屬裸支架植入聯(lián)合口服雷帕霉素能否起到與雷帕霉素洗脫支架植入起到類(lèi)似的效果，進(jìn)而為為冠心病的臨床防治提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 材料與方法:
　　 24只雄性純種新西蘭大白兔，在適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，每只兔均由耳緣靜脈抽取4ml血標(biāo)本，檢測(cè)TC、LDLL、HDLL等血脂變化。對(duì)全部

9、實(shí)驗(yàn)兔行球囊損傷腹主動(dòng)脈，3％戊巴比妥鈉30mg/kg麻醉動(dòng)物后，穿刺右股動(dòng)脈，將內(nèi)徑3.0mm、長(zhǎng)15mm的球囊導(dǎo)管送入降主動(dòng)脈約20cm，14個(gè)大氣壓充盈球囊后反復(fù)回拉3次以造成腹主動(dòng)脈內(nèi)膜損傷，結(jié)扎股動(dòng)脈遠(yuǎn)段，縫合傷口。肌肉注射給予抗生素預(yù)防感染。給予高脂飼料(1％膽固醇，每只120-140g/d_)喂養(yǎng)8周。喂養(yǎng)8周末，每只實(shí)驗(yàn)兔抽取4ml靜脈血測(cè)血脂指標(biāo)，并將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為3組，每組8只。分別為裸支架植入組(BMS組)、裸支

10、架+口服雷帕霉素組(BMS+RAPA組)、雷帕霉素藥物支架組(DES組)。所有動(dòng)物均予以3％戊巴比妥鈉麻醉，暴露右側(cè)股動(dòng)脈，行腹主動(dòng)脈造影，觀察腹主動(dòng)脈斑塊情況，并行IVUS檢查，具體操作如下:分離右股動(dòng)脈，在0.014英寸導(dǎo)引鋼絲及擴(kuò)張管輔助下，立即按100u/kg給予肝素靜注抗凝，沿導(dǎo)引鋼絲在造影影像指引下，插入血管內(nèi)超聲探頭導(dǎo)管，通過(guò)狹窄病變至血管遠(yuǎn)端，然后緩慢回撤探頭導(dǎo)管，測(cè)量預(yù)備置放支架部位的各項(xiàng)指標(biāo):管腔最小直徑(MLD)，

11、血管外彈力膜面積(EEMA)、管腔面積(LA)、斑塊面積(PA)、斑塊負(fù)荷(PB)病變部位及參考部位的血管外彈力膜面積(EEMA)、管腔面積(LA)、斑塊面積(PA)、斑塊最厚處直徑(Dmax)及其對(duì)側(cè)斑塊最薄處直徑(Drain)。按照公式計(jì)算斑塊的偏心指數(shù)(EI)及血管的重構(gòu)指數(shù)(RI):EI=Dmax/Drain，RI=病變處EEMA/參考部位近端與遠(yuǎn)端EEMA平均值。所有支架組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，選擇合適部位(位置選在腎動(dòng)脈下1mm)置放支

12、架，以16-20ATM釋放支架，支架型號(hào)均為3.0*12mm，之后再行IVUS檢查，留存影像，結(jié)扎右側(cè)股動(dòng)脈遠(yuǎn)段，縫合傷口。肌肉注射給予抗生素預(yù)防感染2天。肌肉注射肝素2500u/d周。術(shù)后所有實(shí)驗(yàn)兔繼續(xù)給予高脂喂養(yǎng)4周。其中BMS+RAPA組家兔，給予雷帕霉素口服4周，劑量為0.5mg/kg/d。4周末，每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物抽取4ml靜脈血測(cè)血脂指標(biāo)后，行IVUS檢測(cè)各指標(biāo)并計(jì)算支架組管腔丟失后，全部處死，留取支架部及之間近遠(yuǎn)端血管組織。每只

13、兔的血管組織標(biāo)本取1mm段血管行電鏡檢查找巨噬細(xì)胞后分為兩半，一半甲醛浸泡行HE染色等病理學(xué)研究，一半凍于-80度冰箱行分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用X±s表示，計(jì)數(shù)資料用百分?jǐn)?shù)表示，多組間比較采用ANOVA方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果
　　 (1)IVUS結(jié)果顯示BMS+RAPA組及DES組的PA、PB均明顯小于BMS組(P均＜0.01），而MLD明顯高于BM

14、S組，支架植入4周后管腔丟失明顯小于BMS組（P均＜0.05）;
　　 (2)造模后兔的各項(xiàng)血脂指標(biāo)明顯升高（P＜0.05)（表1），而干預(yù)4周后三組間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（表2）
　　 (3)病理學(xué)檢測(cè)顯示BMS組支架植入后內(nèi)膜增生明顯，管腔面積狹窄率明顯大于BMS+RAPA組及DES組(P＜0.05)，BMS+RAPA組血管內(nèi)皮化良好，而DES組內(nèi)皮化修復(fù)延遲明顯，支架直接暴露于管腔。
　　 (4)干預(yù)4周

15、后BMS+RAPA組及DES組的斑塊局部mTOR表達(dá)明顯低于BMS組(P＜0.05)。
　　 （5)電鏡檢測(cè):干預(yù)四周后BMS組斑塊其間可見(jiàn)泡沫細(xì)胞聚集，BMS+RAPA組及DES組斑塊內(nèi)泡沫細(xì)胞明顯少于BMS組。
　　 結(jié)論
　　 (1)口服雷帕霉素能夠抑制支架植入處的內(nèi)膜增生、防止支架內(nèi)再狹窄，口服雷帕霉素配合裸支架治療具有減少管腔面積丟失、降低斑塊負(fù)荷方面的作用，與雷帕霉素涂層支架作用相似，與裸支架組相比，

16、可以更有效地減小斑塊面積、減少管腔面積丟失，降低再狹窄的發(fā)生率。
　　 (2)口服雷帕霉素配合裸支架與雷帕霉素藥物支架抑制支架內(nèi)再狹窄的作用相似。
　　 (3)雷帕霉素主要是抑制了斑塊局部的mTOR，減少局部斑塊的炎癥反應(yīng)和脂質(zhì)沉積，減少支架內(nèi)平滑肌細(xì)胞的增殖，進(jìn)而抑制了支架內(nèi)再狹窄。
　　 (4)口服雷帕霉素可以有效地減緩斑塊進(jìn)展，而且在裸支架置入的同時(shí)配合口服雷帕霉素，在預(yù)防再狹窄、減少出血等并發(fā)癥方面具有明