口服雷帕霉素抑制mTOR對防止支架內(nèi)再狹窄作用的分子機制的實驗研究.pdf

1、冠心病(coronaryheartdisease，CHD)嚴(yán)重威脅現(xiàn)代人的健康，帶來沉重的社會公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)。根據(jù)世界衛(wèi)生組織2006年公布的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，在全世界15-60歲人群的死因中，腦卒中和冠心病分列第五和第二位。根據(jù)我國衛(wèi)生部公布的數(shù)據(jù)，2005年中國城市居民冠心病死亡率為46.3/10萬。冠心病的病因尚不完全清楚，研究顯示冠心病為多種危險因素作用所致，包括血脂異常、男性、年齡、高血壓病、糖尿病、肥胖、體力活動減少、吸煙、家族史等。

2、冠心病的癥狀常出現(xiàn)于40歲以上的中老年人，致死性心肌梗死的患者中約80％是65歲以上的老年人。目前冠心病的治療主要包括藥物治療、經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(Percutaneouscoronaryintervention，PCI)和冠狀動脈旁路移植術(shù)(Coronaryarterybypassgrafting，CABG)。PCI術(shù)于世紀(jì)七十年代末首次應(yīng)用于臨床，1984年，我國成功進行了第一例PTCA術(shù)，經(jīng)過近幾十年的發(fā)展，PCI術(shù)由最初的單純

3、球囊擴張發(fā)展到后來的裸金屬支架(Barementalstent，BMS)植入，直至現(xiàn)今被廣泛應(yīng)用的藥物洗脫支架(Drugeluntingstent，DES)，隨著技術(shù)的進步與新設(shè)備、新器械的不斷問世，PCI術(shù)現(xiàn)已成為冠心病治療中較為成熟的手段之一。
　　 多中心隨機臨床試驗已證實:冠狀動脈藥物洗脫支架能顯著減少內(nèi)膜增生和再狹窄發(fā)生率（術(shù)后5年內(nèi)約9％～10％），改善癥狀，提高生活質(zhì)量。盡管藥物涂層支架(DES)的廣泛應(yīng)用顯著降低

4、了PCI術(shù)后再狹窄的發(fā)生，但是其卻增加了支架相關(guān)血栓的發(fā)生率，如雷帕霉素涂層支架，在抑制血管平滑肌細(xì)胞增生的同時也造成了植入支架的內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)延遲，容易形成血栓。同時，所有接受DES植入的患者需要接受至少12個月的雙聯(lián)抗血小板治療，增加了術(shù)后出血的風(fēng)險。
　　 mTOR是哺乳類動物細(xì)胞表達的一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。研究發(fā)現(xiàn)，mTOR通路激活參與了動脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展，與炎癥反應(yīng)、脂代謝紊亂存在協(xié)同作用。mTOR信號通路調(diào)

5、控異常與動脈粥樣硬化的發(fā)生密切相關(guān)，而傳統(tǒng)的mTOR抑制劑主要是雷帕霉素及其衍生物，雷帕霉素能抑制與單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞有關(guān)的細(xì)胞因子的產(chǎn)生，包括MCP-1與IL-6。Suzuki等發(fā)現(xiàn)雷帕霉素能有效減低MCP-1mRNA水平。Basso等發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用雷帕霉素具有獨立于降低膽固醇影響之外的抑制動脈粥樣硬化進程的作用。
　　 血管內(nèi)超聲成像技術(shù)(IVUS)是近幾年發(fā)展起來的新型影像學(xué)技術(shù)，在冠脈介入手術(shù)中的價值已日益顯著，由于其能精確

6、的顯示粥樣硬化斑塊的性質(zhì)及血管壁的圖像，能夠準(zhǔn)確判斷支架貼壁與否以及支架后再狹窄的情況，已成為冠心病診斷與治療中的重要輔助手段之一，在認(rèn)識到口服雷帕霉素對斑塊的積極作用后，我們希望借助血管內(nèi)超聲技術(shù)，評估口服雷帕霉素配合金屬裸支架治療減少再狹窄的效果。
　　 同時，在組織學(xué)及病理學(xué)方面，我們應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)、透射電鏡技術(shù)、檢測了靶血管組織的α-actin，mTOR，膠原，脂質(zhì)等各項指標(biāo)，以探求BMS植入加口服雷帕霉素能否達到

7、與DES植入類似的效果，若此法可行，那么將為經(jīng)皮冠狀動脈介入治療術(shù)提供一種全新的方案，在預(yù)防支架內(nèi)在狹窄的同時，還可以降低支架內(nèi)血栓發(fā)生率，并減少術(shù)后雙聯(lián)抗血小板治療的時間，同時降低晚期支架內(nèi)血栓的發(fā)生率。
　　 研究目的:
　　 (1)建立AS動物模型;
　　 (2)通過血管內(nèi)超聲觀察實驗動物腹主動脈粥樣硬化板塊形態(tài)并于特定位置行支架植入術(shù);
　　 (3)測定模型動物干預(yù)前后血生化各項指標(biāo);
　　

8、 (4)聯(lián)合應(yīng)用血管內(nèi)超聲(IVUS)、病理學(xué)及免疫組織化學(xué)技術(shù)，探明口服雷帕霉素抑制支架內(nèi)再狹窄的作用及其分子機制;
　　 (5)觀察金屬裸支架植入聯(lián)合口服雷帕霉素能否起到與雷帕霉素洗脫支架植入起到類似的效果，進而為為冠心病的臨床防治提供理論和實驗依據(jù)。
　　 材料與方法:
　　 24只雄性純種新西蘭大白兔，在適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，每只兔均由耳緣靜脈抽取4ml血標(biāo)本，檢測TC、LDLL、HDLL等血脂變化。對全部

9、實驗兔行球囊損傷腹主動脈，3％戊巴比妥鈉30mg/kg麻醉動物后，穿刺右股動脈，將內(nèi)徑3.0mm、長15mm的球囊導(dǎo)管送入降主動脈約20cm，14個大氣壓充盈球囊后反復(fù)回拉3次以造成腹主動脈內(nèi)膜損傷，結(jié)扎股動脈遠段，縫合傷口。肌肉注射給予抗生素預(yù)防感染。給予高脂飼料(1％膽固醇，每只120-140g/d_)喂養(yǎng)8周。喂養(yǎng)8周末，每只實驗兔抽取4ml靜脈血測血脂指標(biāo)，并將實驗動物隨機分為3組，每組8只。分別為裸支架植入組(BMS組)、裸支

10、架+口服雷帕霉素組(BMS+RAPA組)、雷帕霉素藥物支架組(DES組)。所有動物均予以3％戊巴比妥鈉麻醉，暴露右側(cè)股動脈，行腹主動脈造影，觀察腹主動脈斑塊情況，并行IVUS檢查，具體操作如下:分離右股動脈，在0.014英寸導(dǎo)引鋼絲及擴張管輔助下，立即按100u/kg給予肝素靜注抗凝，沿導(dǎo)引鋼絲在造影影像指引下，插入血管內(nèi)超聲探頭導(dǎo)管，通過狹窄病變至血管遠端，然后緩慢回撤探頭導(dǎo)管，測量預(yù)備置放支架部位的各項指標(biāo):管腔最小直徑(MLD)，

11、血管外彈力膜面積(EEMA)、管腔面積(LA)、斑塊面積(PA)、斑塊負(fù)荷(PB)病變部位及參考部位的血管外彈力膜面積(EEMA)、管腔面積(LA)、斑塊面積(PA)、斑塊最厚處直徑(Dmax)及其對側(cè)斑塊最薄處直徑(Drain)。按照公式計算斑塊的偏心指數(shù)(EI)及血管的重構(gòu)指數(shù)(RI):EI=Dmax/Drain，RI=病變處EEMA/參考部位近端與遠端EEMA平均值。所有支架組實驗動物，選擇合適部位(位置選在腎動脈下1mm)置放支

12、架，以16-20ATM釋放支架，支架型號均為3.0*12mm，之后再行IVUS檢查，留存影像，結(jié)扎右側(cè)股動脈遠段，縫合傷口。肌肉注射給予抗生素預(yù)防感染2天。肌肉注射肝素2500u/d周。術(shù)后所有實驗兔繼續(xù)給予高脂喂養(yǎng)4周。其中BMS+RAPA組家兔，給予雷帕霉素口服4周，劑量為0.5mg/kg/d。4周末，每只實驗動物抽取4ml靜脈血測血脂指標(biāo)后，行IVUS檢測各指標(biāo)并計算支架組管腔丟失后，全部處死，留取支架部及之間近遠端血管組織。每只

13、兔的血管組織標(biāo)本取1mm段血管行電鏡檢查找巨噬細(xì)胞后分為兩半，一半甲醛浸泡行HE染色等病理學(xué)研究，一半凍于-80度冰箱行分子生物學(xué)實驗。統(tǒng)計分析采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，計量資料用X±s表示，計數(shù)資料用百分?jǐn)?shù)表示，多組間比較采用ANOVA方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果
　　 (1)IVUS結(jié)果顯示BMS+RAPA組及DES組的PA、PB均明顯小于BMS組(P均＜0.01），而MLD明顯高于BM

14、S組，支架植入4周后管腔丟失明顯小于BMS組（P均＜0.05）;
　　 (2)造模后兔的各項血脂指標(biāo)明顯升高（P＜0.05)（表1），而干預(yù)4周后三組間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。（表2）
　　 (3)病理學(xué)檢測顯示BMS組支架植入后內(nèi)膜增生明顯，管腔面積狹窄率明顯大于BMS+RAPA組及DES組(P＜0.05)，BMS+RAPA組血管內(nèi)皮化良好，而DES組內(nèi)皮化修復(fù)延遲明顯，支架直接暴露于管腔。
　　 (4)干預(yù)4周

15、后BMS+RAPA組及DES組的斑塊局部mTOR表達明顯低于BMS組(P＜0.05)。
　　 （5)電鏡檢測:干預(yù)四周后BMS組斑塊其間可見泡沫細(xì)胞聚集，BMS+RAPA組及DES組斑塊內(nèi)泡沫細(xì)胞明顯少于BMS組。
　　 結(jié)論
　　 (1)口服雷帕霉素能夠抑制支架植入處的內(nèi)膜增生、防止支架內(nèi)再狹窄，口服雷帕霉素配合裸支架治療具有減少管腔面積丟失、降低斑塊負(fù)荷方面的作用，與雷帕霉素涂層支架作用相似，與裸支架組相比，

16、可以更有效地減小斑塊面積、減少管腔面積丟失，降低再狹窄的發(fā)生率。
　　 (2)口服雷帕霉素配合裸支架與雷帕霉素藥物支架抑制支架內(nèi)再狹窄的作用相似。
　　 (3)雷帕霉素主要是抑制了斑塊局部的mTOR，減少局部斑塊的炎癥反應(yīng)和脂質(zhì)沉積，減少支架內(nèi)平滑肌細(xì)胞的增殖，進而抑制了支架內(nèi)再狹窄。
　　 (4)口服雷帕霉素可以有效地減緩斑塊進展，而且在裸支架置入的同時配合口服雷帕霉素，在預(yù)防再狹窄、減少出血等并發(fā)癥方面具有明