雷帕霉素對雙側輸尿管梗阻再通大鼠腎臟的保護作用.pdf

1、腎臟具有排泄體內代謝廢物，維持機體內環(huán)境穩(wěn)定的功能。泌尿系梗阻發(fā)生后，因尿液不斷產(chǎn)生使腎盂內壓力增高，而后導致腎小球及腎小管壓力升高，影響腎臟功能，如GFR下降，腎小管損傷，出現(xiàn)低滲性多尿現(xiàn)象，腎盂內壓力升高可造成腎臟缺血，從而導致腎纖維化及腎實質萎縮，早期解除梗阻，腎功能基本可以恢復，但恢復緩慢。腎間質纖維化是各種原因所致腎臟疾病進展至終末期腎病(end-stage renal disease ESRD)的共同病變過程。其發(fā)病機制主要

2、為小管上皮細胞轉分化，腎小管萎縮，成纖維細胞激活，細胞外基質過量積聚等。因此，早期阻斷間質纖維化的進展對腎功能的恢復具有重要作用。
　　 雷帕霉素(rapamycin)是從放線菌培養(yǎng)液中分離出來的一種大環(huán)內脂類抗生素，現(xiàn)已作為一種免疫抑制劑廣泛應用于各種器官移植領域。雷帕霉素在體內的作用靶點為mTOR(mammalian target of rapamycin)，mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它是一種重要的信號傳導分子，

3、參與細胞的生長增殖、能量代謝的調節(jié)、蛋白質等的合成，雷帕霉素通過與mTOR結合，通過阻斷mTOR活性發(fā)揮免疫抑制作用。此外，它還能抑制平滑肌細胞、內皮細胞和成纖維細胞等增殖，從而改善腎臟微循環(huán)減輕腎組織損傷。有研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素可以顯著緩解膜性腎病大鼠模型的小管間質炎癥及纖維化，可以有效抑制TGF-β1等的表達。
　　 本研究通過雙側輸尿管梗阻再通模型，動態(tài)觀察雷帕霉素對梗阻再通腎臟的腎功能恢復的影響，觀察雷帕霉素對大鼠腎臟組織

4、TGF-β1、α-SMA、KIM-1及IL-18等相關因子表達的影響來探討雷帕霉素對泌尿系梗阻腎臟的保護作用。
　　 第一部分、雷帕霉素對雙側輸尿管梗阻再通大鼠腎臟功能的影響
　　 材料與方法:
　　 1.動物模型制備與分組給藥48只雄性健康SD大鼠，隨機均分為假手術組、BUO組和雷帕霉素治療組，每組16只。BUO組、雷帕霉素組兩組大鼠制作BUOR模型:以顯微止血夾夾閉雙側輸尿管，術后24h取出雙側顯微止血夾，解

5、除輸尿管梗阻。假手術組僅游離雙側輸尿管后縫合皮膚。雷帕霉素組于術前1d至處死當天每天予以雷帕霉素口服液（2mg.kg-1.d-1）灌胃。假手術組及BUO組用等體積生理鹽水灌胃。
　　 2.標本提取與保存假手術組、BUO組、雷帕霉素組分別于術后第4、7天各處死8只，于處死前一天將大鼠置于代謝籠中（禁食不禁水）收集24h尿液，測得24h尿量以及尿比重，靜脈取血全自動生化分析儀檢測血肌酐、尿素氮以及血電解質。留取兩側腎臟，橫切為兩部分

6、，一部分置于4％多聚甲醛固定，用于石蠟切片制作，另一部分組織經(jīng)液氮速凍后保存于-80°冰箱。
　　 結果:
　　 1.各組大鼠24h尿液檢測結果術后第4天及第7天，與假手術組相比，BUO組及雷帕霉素組大鼠尿量明顯增多，尿比重下降，與BUO組相比，雷帕霉素組尿量相對減少，尿比重高于BUO組，統(tǒng)計學顯示差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）;與術后第4天相比，術后第7天各組尿量減少，尿比重升高，統(tǒng)計學顯示差異具有統(tǒng)計學意義(P＜

7、0.05）。
　　 2.各組大鼠腎功能、血電解質的比較術后第4天及第7天，雷帕霉素組血清鈉均高于同時間點BUO組，低于假手術組，統(tǒng)計學顯示無顯著性差異（P＞0.05），BUO組大鼠血清鉀、血肌酐及尿素氮升高顯著，雷帕霉素組血清鉀、血肌酐及尿素氮低于BUO組，但高于假手術組，統(tǒng)計學顯示差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）。
　　 結論:
　　 雷帕霉素可減輕泌尿系梗阻解除后的水電解質代謝紊亂，加速腎功能的恢復，對梗阻

8、腎臟具保護作用。
　　 第二部分、雷帕霉素對雙側輸尿管梗阻再通大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA表達的影響
　　 材料與方法:
　　 1.動物模型制備與分組給藥同第一部分。
　　 2.免疫組織化學法檢測TGF-β1及α-SMA蛋白的表達3.蛋白質印跡（Western Blotting）測定TGF-β1及α-SMA蛋白表達。
　　 結果:
　　 1.各組大鼠腎組織TGF-β1及α-SMA蛋白

9、的免疫組織化學分析
　　 1.1 各組大鼠腎組織TGF-β1及α-SMA蛋白的表達及分布在假手術組，TGF-β1在腎間質以及腎小管上皮細胞僅有少量表達，各時間點表達一致，α-SMA在各時間點腎間質和腎小管上皮細胞未見表達;與假手術組相比，BUO組、雷帕霉素組可見TGF-β1、α-SMA在腎小管上皮細胞及腎間質表達明顯增加，BUO組二者表達增加較雷帕霉素組更為顯著。
　　 1.2 各組大鼠腎組織TGF-β1及α-SMA蛋白

10、的免疫組織化學半定量分析BUO組術后第4天，TGF-β1、α-SMA蛋白表達均顯著高于假手術組（P＜0.05），術后第7天BUO組二者的表達相對減少，但仍高于假手術組(P＜0.05)。雷帕霉素組術后第4、7天TGF-β1、α-SMA的表達均低于同時間點的BUO組(P＜0.05)，但仍高于假手術組(P＜0.05)。
　　 2.TGF-β1及α-SMA蛋白表達的Western Blotting定量測定蛋白表達行western blo

11、tting定量分析顯示，BUO組術后第4天，TGF-β1、α-SMA、蛋白表達均高于假手術組(P＜0.05)，第7天BUO組二者的表達較第4天相對減少，但仍高于假手術組(P＜0.05)。雷帕霉素組TGF-β1、α-SMA的表達均低于同時間點的BUO組(P＜0.05)，但高于假手術組(P＜0.05)。
　　 結論:在雙側輸尿管梗阻再通大鼠模型中，雷帕霉素可以下調TGF-β1及α-SMA蛋白表達，減輕腎臟纖維化，有利于腎功能的恢復。

12、
　　 第三部分、雷帕霉素對雙側輸尿管梗阻再通大鼠腎組織KIM-1、IL-18表達的影響
　　 材料與方法:
　　 1.動物模型制備及分組給藥同第一部分。
　　 2.免疫組織化學法檢測KIM-1、IL-18蛋白的表達。
　　 3.Western Blotting檢測KIM-1、IL-18蛋白的表達。
　　 結果:
　　 1.各組大鼠腎組織KIM-1、IL-18蛋白的免疫組織化學分析

13、
　　 1.1 各組大鼠腎組織KIM-1、IL-18蛋白的表達及分布在假手術組，各時間點IL-18在腎間質和腎小管上皮細胞有少量表達，腎近曲小管可見KIM-1極少量表達。與假手術組相比，BUO組、雷帕霉素組可見KIM-1、IL-18表達增加，BUO增加更為顯著，與第4天相比較，BUO組、雷帕霉素組在第7天KIM-1、IL-18的表達相對減少。
　　 1.2 各組大鼠腎組織KIM-1、IL-18蛋白的免疫組織化學半定量分析

14、BUO組術后第4天， KIM-1及IL-18蛋白表達均顯著高于假手術組(P＜0.05)，術后第7天BUO組的表達相對減少，但仍高于假手術組(P＜0.05)。雷帕霉素組術后第4、7天KIM-1及IL-18的表達均低于同時間點的BUO組(P＜0.05)，但高于假手術組（P＜0.05）。
　　 2.KIM-1及IL-18蛋白表達的Western Blotingt定量測定蛋白表達行western blotting定量分析顯示，BUO組術

15、后第4天，KIM-1及IL-18蛋白表達均高于假手術組(P＜0.05)，第7天BUO組二者的表達相對減少，但仍高于假手術組(P＜0.05)。雷帕霉素組術后第4、7天KIM-1及IL-18的表達均低于同時間點的BUO組(P＜0.05)，但高于假手術組(P＜0.05)。
　　 結論:雷帕霉素可下調KIM-1、IL-18在腎小管的表達，有利于減輕腎小管的損傷，從而減輕泌尿系梗阻解除后的水電解質代謝紊亂，保護梗阻腎功能。