雷帕霉素對雙側(cè)輸尿管梗阻再通大鼠腎臟的保護作用.pdf

1、腎臟具有排泄體內(nèi)代謝廢物，維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的功能。泌尿系梗阻發(fā)生后，因尿液不斷產(chǎn)生使腎盂內(nèi)壓力增高，而后導致腎小球及腎小管壓力升高，影響腎臟功能，如GFR下降，腎小管損傷，出現(xiàn)低滲性多尿現(xiàn)象，腎盂內(nèi)壓力升高可造成腎臟缺血，從而導致腎纖維化及腎實質(zhì)萎縮，早期解除梗阻，腎功能基本可以恢復，但恢復緩慢。腎間質(zhì)纖維化是各種原因所致腎臟疾病進展至終末期腎病(end-stage renal disease ESRD)的共同病變過程。其發(fā)病機制主要

2、為小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化，腎小管萎縮，成纖維細胞激活，細胞外基質(zhì)過量積聚等。因此，早期阻斷間質(zhì)纖維化的進展對腎功能的恢復具有重要作用。
　　 雷帕霉素(rapamycin)是從放線菌培養(yǎng)液中分離出來的一種大環(huán)內(nèi)脂類抗生素，現(xiàn)已作為一種免疫抑制劑廣泛應(yīng)用于各種器官移植領(lǐng)域。雷帕霉素在體內(nèi)的作用靶點為mTOR(mammalian target of rapamycin)，mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它是一種重要的信號傳導分子，

3、參與細胞的生長增殖、能量代謝的調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)等的合成，雷帕霉素通過與mTOR結(jié)合，通過阻斷mTOR活性發(fā)揮免疫抑制作用。此外，它還能抑制平滑肌細胞、內(nèi)皮細胞和成纖維細胞等增殖，從而改善腎臟微循環(huán)減輕腎組織損傷。有研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素可以顯著緩解膜性腎病大鼠模型的小管間質(zhì)炎癥及纖維化，可以有效抑制TGF-β1等的表達。
　　 本研究通過雙側(cè)輸尿管梗阻再通模型，動態(tài)觀察雷帕霉素對梗阻再通腎臟的腎功能恢復的影響，觀察雷帕霉素對大鼠腎臟組織

4、TGF-β1、α-SMA、KIM-1及IL-18等相關(guān)因子表達的影響來探討雷帕霉素對泌尿系梗阻腎臟的保護作用。
　　 第一部分、雷帕霉素對雙側(cè)輸尿管梗阻再通大鼠腎臟功能的影響
　　 材料與方法:
　　 1.動物模型制備與分組給藥48只雄性健康SD大鼠，隨機均分為假手術(shù)組、BUO組和雷帕霉素治療組，每組16只。BUO組、雷帕霉素組兩組大鼠制作BUOR模型:以顯微止血夾夾閉雙側(cè)輸尿管，術(shù)后24h取出雙側(cè)顯微止血夾，解

5、除輸尿管梗阻。假手術(shù)組僅游離雙側(cè)輸尿管后縫合皮膚。雷帕霉素組于術(shù)前1d至處死當天每天予以雷帕霉素口服液（2mg.kg-1.d-1）灌胃。假手術(shù)組及BUO組用等體積生理鹽水灌胃。
　　 2.標本提取與保存假手術(shù)組、BUO組、雷帕霉素組分別于術(shù)后第4、7天各處死8只，于處死前一天將大鼠置于代謝籠中（禁食不禁水）收集24h尿液，測得24h尿量以及尿比重，靜脈取血全自動生化分析儀檢測血肌酐、尿素氮以及血電解質(zhì)。留取兩側(cè)腎臟，橫切為兩部分

6、，一部分置于4％多聚甲醛固定，用于石蠟切片制作，另一部分組織經(jīng)液氮速凍后保存于-80°冰箱。
　　 結(jié)果:
　　 1.各組大鼠24h尿液檢測結(jié)果術(shù)后第4天及第7天，與假手術(shù)組相比，BUO組及雷帕霉素組大鼠尿量明顯增多，尿比重下降，與BUO組相比，雷帕霉素組尿量相對減少，尿比重高于BUO組，統(tǒng)計學顯示差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）;與術(shù)后第4天相比，術(shù)后第7天各組尿量減少，尿比重升高，統(tǒng)計學顯示差異具有統(tǒng)計學意義(P＜

7、0.05）。
　　 2.各組大鼠腎功能、血電解質(zhì)的比較術(shù)后第4天及第7天，雷帕霉素組血清鈉均高于同時間點BUO組，低于假手術(shù)組，統(tǒng)計學顯示無顯著性差異（P＞0.05），BUO組大鼠血清鉀、血肌酐及尿素氮升高顯著，雷帕霉素組血清鉀、血肌酐及尿素氮低于BUO組，但高于假手術(shù)組，統(tǒng)計學顯示差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 雷帕霉素可減輕泌尿系梗阻解除后的水電解質(zhì)代謝紊亂，加速腎功能的恢復，對梗阻

8、腎臟具保護作用。
　　 第二部分、雷帕霉素對雙側(cè)輸尿管梗阻再通大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA表達的影響
　　 材料與方法:
　　 1.動物模型制備與分組給藥同第一部分。
　　 2.免疫組織化學法檢測TGF-β1及α-SMA蛋白的表達3.蛋白質(zhì)印跡（Western Blotting）測定TGF-β1及α-SMA蛋白表達。
　　 結(jié)果:
　　 1.各組大鼠腎組織TGF-β1及α-SMA蛋白

9、的免疫組織化學分析
　　 1.1 各組大鼠腎組織TGF-β1及α-SMA蛋白的表達及分布在假手術(shù)組，TGF-β1在腎間質(zhì)以及腎小管上皮細胞僅有少量表達，各時間點表達一致，α-SMA在各時間點腎間質(zhì)和腎小管上皮細胞未見表達;與假手術(shù)組相比，BUO組、雷帕霉素組可見TGF-β1、α-SMA在腎小管上皮細胞及腎間質(zhì)表達明顯增加，BUO組二者表達增加較雷帕霉素組更為顯著。
　　 1.2 各組大鼠腎組織TGF-β1及α-SMA蛋白

10、的免疫組織化學半定量分析BUO組術(shù)后第4天，TGF-β1、α-SMA蛋白表達均顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05），術(shù)后第7天BUO組二者的表達相對減少，但仍高于假手術(shù)組(P＜0.05)。雷帕霉素組術(shù)后第4、7天TGF-β1、α-SMA的表達均低于同時間點的BUO組(P＜0.05)，但仍高于假手術(shù)組(P＜0.05)。
　　 2.TGF-β1及α-SMA蛋白表達的Western Blotting定量測定蛋白表達行western blo

11、tting定量分析顯示，BUO組術(shù)后第4天，TGF-β1、α-SMA、蛋白表達均高于假手術(shù)組(P＜0.05)，第7天BUO組二者的表達較第4天相對減少，但仍高于假手術(shù)組(P＜0.05)。雷帕霉素組TGF-β1、α-SMA的表達均低于同時間點的BUO組(P＜0.05)，但高于假手術(shù)組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:在雙側(cè)輸尿管梗阻再通大鼠模型中，雷帕霉素可以下調(diào)TGF-β1及α-SMA蛋白表達，減輕腎臟纖維化，有利于腎功能的恢復。

12、
　　 第三部分、雷帕霉素對雙側(cè)輸尿管梗阻再通大鼠腎組織KIM-1、IL-18表達的影響
　　 材料與方法:
　　 1.動物模型制備及分組給藥同第一部分。
　　 2.免疫組織化學法檢測KIM-1、IL-18蛋白的表達。
　　 3.Western Blotting檢測KIM-1、IL-18蛋白的表達。
　　 結(jié)果:
　　 1.各組大鼠腎組織KIM-1、IL-18蛋白的免疫組織化學分析

13、
　　 1.1 各組大鼠腎組織KIM-1、IL-18蛋白的表達及分布在假手術(shù)組，各時間點IL-18在腎間質(zhì)和腎小管上皮細胞有少量表達，腎近曲小管可見KIM-1極少量表達。與假手術(shù)組相比，BUO組、雷帕霉素組可見KIM-1、IL-18表達增加，BUO增加更為顯著，與第4天相比較，BUO組、雷帕霉素組在第7天KIM-1、IL-18的表達相對減少。
　　 1.2 各組大鼠腎組織KIM-1、IL-18蛋白的免疫組織化學半定量分析

14、BUO組術(shù)后第4天， KIM-1及IL-18蛋白表達均顯著高于假手術(shù)組(P＜0.05)，術(shù)后第7天BUO組的表達相對減少，但仍高于假手術(shù)組(P＜0.05)。雷帕霉素組術(shù)后第4、7天KIM-1及IL-18的表達均低于同時間點的BUO組(P＜0.05)，但高于假手術(shù)組（P＜0.05）。
　　 2.KIM-1及IL-18蛋白表達的Western Blotingt定量測定蛋白表達行western blotting定量分析顯示，BUO組術(shù)

15、后第4天，KIM-1及IL-18蛋白表達均高于假手術(shù)組(P＜0.05)，第7天BUO組二者的表達相對減少，但仍高于假手術(shù)組(P＜0.05)。雷帕霉素組術(shù)后第4、7天KIM-1及IL-18的表達均低于同時間點的BUO組(P＜0.05)，但高于假手術(shù)組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:雷帕霉素可下調(diào)KIM-1、IL-18在腎小管的表達，有利于減輕腎小管的損傷，從而減輕泌尿系梗阻解除后的水電解質(zhì)代謝紊亂，保護梗阻腎功能。