雷帕霉素對自身免疫性肝炎的作用及機(jī)制.pdf

1、一.雷帕霉素對刀豆蛋白A誘導(dǎo)的急性肝損傷的作用及機(jī)制
　　目的：
　　觀察尾靜脈注射不同濃度刀豆蛋白A(ConcanavalinA, ConA)后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠的肝臟損傷、血清學(xué)變化，從而確定造模的最佳劑量與時(shí)間。研究ConA對脾臟樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T、B淋巴細(xì)胞表型的影響，從而探討ConA模擬自身免疫性肝炎的發(fā)病機(jī)制。進(jìn)一步探討雷帕霉素對刀豆蛋白 A（ConA）誘導(dǎo)的急性肝損傷的治療作用，并分析其發(fā)揮作用的機(jī)制。

2、>　　方法：
　　1.建立急性肝損傷小鼠模型：8周齡雌性C57BL/6小鼠，平均體重20g。按ConA濃度隨機(jī)分為10 mg/kg、15mg/kg、20 mg/kg三組，分別于注射ConA后的6h、24h、48h隨機(jī)取6只小鼠，檢測小鼠血清生化水平（AST、ALT）；肝組織進(jìn)行HE染色并作出評分。
　　2.雷帕霉素對急性肝損傷的防治作用：隨機(jī)分為對照組、ConA造模組和 ConA造模+雷帕霉素（RAPA）治療組。雷帕霉素處理

3、2h后尾靜脈注射ConA，24h后檢測各組小鼠血清ALT和AST水平；肝組織行HE染色并病理評分。
　　3.流式細(xì)胞分析術(shù)檢測脾臟樹突狀細(xì)胞（DC，MHC-Ⅱ+CD11C+）的比例及表面共刺激分子 CD40、CD80、CD86的表達(dá)情況，同時(shí)檢測 CD4+T、CD8+T及CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的比例變化及巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞的變化情況。
　　結(jié)果：
　　1.隨著ConA劑量的增大對肝臟的損傷逐漸加重，1

4、0mg/kg劑量對小鼠的肝損傷不顯著，可見局部點(diǎn)狀壞死。15mg/kg劑量可引起點(diǎn)狀或片狀壞死。20mg/kg的劑量注射后24小時(shí)內(nèi)小鼠會死亡。ConA組小鼠血清ALT、AST的水平較對照組（PBS組）明顯升高，且ConA注射劑量與小鼠血清ALT、AST的水平呈正相關(guān)。
　　2.ConA對脾臟免疫細(xì)胞的影響主要體現(xiàn)在CD4+T細(xì)胞比例顯著上調(diào)，巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞的比例呈升高趨勢，且樹突狀細(xì)胞共刺激分子（CD80、CD86

5、）顯著上調(diào)。
　　3.RAPA治療組小鼠的血清AST和ALT的水平較ConA組降低，肝臟組織壞死及炎細(xì)胞浸潤程度較輕；可以下調(diào)DC的CD80、CD86共刺激分子的表達(dá)，同時(shí)降低 CD4+T和 CD8+T細(xì)胞占脾臟細(xì)胞的比例，并且能夠促進(jìn)CD4+CD25+Treg的表達(dá);PAPA對樹突狀細(xì)胞共刺激分子CD40的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1.ConA使小鼠脾臟細(xì)胞以CD4+T細(xì)胞浸潤為主，B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀

6、細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞的表達(dá)有升高的趨勢，且使樹突狀細(xì)胞的共刺激分子（CD80、CD86）表達(dá)上調(diào)。
　　2.雷帕霉素可以減緩ConA誘導(dǎo)的急性肝損傷，主要通過影響T細(xì)胞和DC來發(fā)揮免疫抑制的作用，為自身免疫性肝炎的治療提供了理論依據(jù)。
　　二．雷帕霉素對自身免疫性肝炎肝纖維化的防治作用
　　目的：
　　通過定量多次尾靜脈注射ConA建立小鼠自身免疫性肝炎肝纖維化模型，檢測肝臟淋巴細(xì)胞表型及CD4+T細(xì)胞的亞型Th1

7、，Th2，Th3，Tr1細(xì)胞的變化情況，從而探討雷帕霉素對其防治作用。
　　方法：
　　1.建立自身免疫性肝炎肝纖維化模型：8周齡雌性 C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對照組、ConA造模組、ConA造模+雷帕霉素（rapamycin，RAPA）治療組。正常對照組每周一次尾靜脈注射磷酸鹽緩沖液（PBS），模型組和治療組每周一次尾靜脈注射ConA,三組均連續(xù)注射5周。
　　2.評價(jià)雷帕霉素的治療效果：檢測各組小鼠血清生化水平；

8、肝臟組織行HE和Masson染色，并行評價(jià)肝臟組織炎癥及纖維化程度。
　　3.梯度離心法分離肝臟單個(gè)核細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測 CD4+T、CD8+T細(xì)胞的比例，并檢測免疫細(xì)胞內(nèi)干擾素γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素4（IL-4）、白細(xì)胞介素10（IL-10）、轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　CCR7的表達(dá)，并促進(jìn)其運(yùn)動速度。
　　1.ConA連續(xù)注射第5周時(shí)開始出現(xiàn)肝纖維化。雷帕霉素治療組與

9、ConA造模組小鼠相比，血清ALT水平顯著降低(p<0.05)；肝臟組織炎癥損傷明顯減輕，并無明顯纖維組織增生；
　　2.雷帕霉素治療組與ConA造模組小鼠相比肝臟單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)TGF-β的表達(dá)顯著降低（p<0.05）；肝臟CD4+T和CD8+T細(xì)胞的比例均下調(diào)（p<0.05）；Th1細(xì)胞的比例降低（p<0.05），Th3、Tr1調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞的比例顯著上調(diào)（p<0.05），但Th2細(xì)胞的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。
　

10、　結(jié)論：
　　雷帕霉素可以減緩Con A誘導(dǎo)的慢性肝炎肝纖維化的炎癥程度，與促進(jìn)肝臟Th3/Tr1細(xì)胞的分化，減少肝臟單個(gè)核細(xì)胞TGF-β的表達(dá)有關(guān)。
　　三.雷帕霉素通過誘導(dǎo)免疫耐受性樹突狀細(xì)胞的形成減緩自身免疫性肝炎
　　目的：
　　觀察雷帕霉素對樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)的共刺激分子及趨化受體的表達(dá)、細(xì)胞因子、運(yùn)動速度、特異性免疫反應(yīng)及誘導(dǎo)Treg的能力的影響，探討耐受性樹突狀細(xì)胞

11、在自身免疫性肝炎中的作用機(jī)制，同時(shí)也為治療及預(yù)防自身免疫性肝病提供新的思路。
　　方法：
　　1.免疫磁珠分選CD11C陽性的樹突狀細(xì)胞，雷帕霉素刺激后流式檢測共刺激分子及趨化受體表達(dá)況，并利用活細(xì)胞工作站觀察其動態(tài)運(yùn)動情況。利用 Elisa檢測上清中細(xì)胞因子IL-12，IL-6的表達(dá)情況。
　　2.體外誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)：將分選的DC與CFSE標(biāo)記的OT-I，OT-Ⅱ，CD4+CD25-的T細(xì)胞分別共培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀檢測其誘導(dǎo)

12、分化及增殖能力。
　　結(jié)果：
　　1.雷帕霉素刺激后的樹突狀細(xì)胞低表達(dá)共刺激分子（CD80、CD86）、抑制促炎因子的表達(dá)(IL-6、IL-12)，符合耐受性樹突狀細(xì)胞的特征。促進(jìn)DC趨化受體CCR7的表達(dá)，并促進(jìn)其運(yùn)動速度。
　　2.雷帕霉素抑制特異性反應(yīng)中 CD4+T和 CD8+T細(xì)胞的增殖，并可以誘導(dǎo)CD4+CD25-的T細(xì)胞分化為CD4+CD25+的Treg。
　　結(jié)論：
　　1.雷帕霉素刺激后的樹