HSP70調控雷帕霉素對鼻咽癌細胞生長抑制作用分子機制研究.pdf

1、鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma,NPC)是我國南方常見的惡性腫瘤之一,發(fā)病率為10～50/10萬人口,死亡率在全身惡性腫瘤中的比例,全國第八,兩廣居第三位。目前該病的治療仍然以放射治療為主。對放療不敏感、放療后復發(fā)以及中晚期的患者,可采取化學藥物治療。但傳統(tǒng)的放、化療存在特異性抗腫瘤能力低、殺傷指數(shù)過小、副作用大等缺點。
　　 分子靶向治療作為腫瘤學研究的一個新興的熱點對于改善臨床鼻咽癌的療效具有重要意

2、義。它針對可能導致細胞癌變的環(huán)節(jié),如細胞信號傳導通路、原癌基因和抑癌基因、細胞因子及受體、抗腫瘤血管形成、自殺基因等,從分子水平來逆轉這種惡性生物學行為,從而抑制腫瘤細胞生長,甚至使其完全消退的一種全新的生物治療模式。雷帕霉素作為一種新型的分子靶向治療藥物,在諸多實體瘤中取得了不同程度的療效,其中部分研究已經進入了Ⅲ期臨床試驗,成果令人鼓舞,同時讓我們對雷帕霉素治療鼻咽癌的效果充滿了期待。如果雷帕霉素能夠成功用于鼻咽癌的分子靶向治療,不

3、僅能造?；颊?提高生存率,還能產生相當?shù)慕洕б婧蜕鐣б妗?br>　　 本研究以雷帕霉素為切入點,探討該藥物對不同生物學特性的鼻咽癌細胞所產生的生長抑制作用及其蛋白質分子機制。并以此為基礎,進一步揭示沉默鼻咽癌中HSP70表達對雷帕霉素抑制作用的影響以及相關依據初探。整個研究內容分三部分進行:
　　 第一部分雷帕霉素靶向阻斷mTOR信號通路對人鼻咽癌細胞生長的影響
　　 方法：
　　 通過MTS法確定roTO

4、R抑制劑雷帕霉素作用三株鼻咽癌細胞產生最佳生長抑制率所需濃度和作用時間。
　　 結果：
　　 1.雷帕霉素對不同生物學特性的鼻咽癌細胞均有抑制其生長的作用,該作用的發(fā)揮可能是通過靶向抑制mTOR激酶活性來實現(xiàn)的;
　　 2.抑制率呈現(xiàn)劑量和時間依賴性,不同細胞株之間無顯著差別,基本穩(wěn)定在400％～50％之間,最高為53.9％;
　　 3.對于三個細胞株而言,100nM雷帕霉素作用48小時均能讓藥物所致生長

5、抑制率進入平臺期。
　　 第二部分雷帕霉素靶向抑制人鼻咽癌細胞生長蛋白質分子機制
　　 方法：
　　 1.采用Western Blotting法檢測不同濃度雷帕霉素作用下三株細胞內P13K/Akt/mTOR信號通路中關鍵性蛋白標記物(p-Akt Ser473、Akt、p-mTOR Ser2448、mTOR)表達情況;
　　 2.采用Western Blotting法檢測100nM雷帕霉素作用不同時間后三株

6、細胞內P13K/Akt/mTOR信號通路中關鍵性蛋白標記物(p-AktSer473、Akt、p-mTOR Ser2448、mTOR)表達情況。
　　 結果：
　　 1.CNE-1和6-10B細胞p-mTOR Ser2448表達情況表現(xiàn)出一定的濃度、時間依賴性,而5-8F細胞中該指標不隨藥物濃度和作用時間改變而變化;
　　 2.6-10B和5-8F細胞p-Akt Ser473隨藥物濃度增加而表達增高,而CNE-1則

7、呈“上升-下降”趨勢;
　　 3.三個細胞株p-Akt Ser473當100nM雷帕霉素作用不同時間后,在1hr時表達明顯增高,隨著藥物作用時間繼續(xù)延長,表達較1hr相比有下降,但是除6-10B外,均比0hr高;
　　 4.mTOR、Akt、HSP70的表達保持相對穩(wěn)定,未呈現(xiàn)明顯時間、劑量依賴性改變。
　　 第三部分沉默HSP70調控雷帕霉素對鼻咽癌細胞生長抑制作用蛋白質分子機制研究
　　 方法：

8、>　　 1.分別采用RT-PCR法和Western Blotting法初步驗證HSP70siRNA在鼻咽癌細胞株中使目標基因/蛋白產生滿意沉默效果所需作用時間;
　　 2.采用MTS法進行Control siRNA組、HSP70 siRNA組、ControlsiRNA+100nM Rapa組和HSP70 siRNA+100nM Rapa組組間生長抑制率比較;
　　 3.采用光學顯微鏡明視野觀察不同干預措施下的四組細胞形

9、態(tài)學變化;
　　 4.采用Western Blotting法檢測Control siRNA組、HSP70 siRNA組、Control siRNA+100nM Rapa組和HSP70 siRNA+100nM Rapa組細胞中P13K/Akt/mTOR信號通路中關鍵性蛋白標記物(p-AktSer473、Akt、p-mTOR Ser2448、mTOR)表達情況。
　　 結果：
　　 1.RT-PCR法顯示siRNA作

10、用48hrs,在基因水平可達到HSP70相對較高抑制率,而Western Blotting法顯示siRNA作用72hrs,可在蛋白質水平達到HSP70相對較高抑制率;
　　 2.三個細胞株中四個不同干預組互相比較,HSP70 siRNA+100nM Rapa組生長抑制率最高;
　　 3.與Control siRNA組比較,Control siRNA+100nM Rapa組與第二部分的Rapa作用48hrs的情況相類似,能

11、夠提升細胞中p-AktSer473表達,而HSP70 siRNA+100nM Rapa組中,p-Akt Ser473表達下降;
　　 4.與單用siRNA組別比較,Comrol siRNA+100nM Rapa和HSP70 siRNA+100nM Rapa組中,CNE-1和6-10B細胞p-mTORSer2448表達下調,而5-8F無明顯變化;
　　 5.mTOR、Akt的表達組間比較無明顯變化。
　　 結論：<

12、br>　　 本文采用MTS法、Western Blotting法、脂質體瞬時轉染技術并輔以逆轉錄-聚合酶鏈反應等實驗方法研究雷帕霉素對不同生物學特性的人鼻咽癌細胞株生長抑制作用,并通過檢測P13K/Akt/mTOR.信號通路中關鍵蛋白標記物揭示細胞生長抑制現(xiàn)象產生的相關機制,接著觀察雷帕霉素對HSP70表達下調的鼻咽癌細胞所產生的影響,最后初步探討HSP70 siRNA與雷帕霉素聯(lián)合抑制鼻咽癌細胞生長所涉及的相關機制,得出如下結論:<

13、br>　　 1.雷帕霉素在體外能夠一定程度抑制鼻咽癌細胞株的生長,不同細胞株之間抑制率無明顯差異;
　　 2.雷帕霉素抑制p-mTOR Ser2448表達和mTOR的激酶活性是導致細胞生長抑制產生的原因;
　　 3.雷帕霉素誘導p-Akt Ser473表達上調是導致藥物對鼻咽癌細胞株生長抑制率不高的原因之一;
　　 4.雷帕霉素能夠引起部分細胞株p-mTOR Ser2448表達下調,但是這并非反映生長抑制率情況