L-精氨酸-一氧化氮途徑對病理性心肌肥大形成的抑制作用及相關機制.pdf

1、本實驗利用腹主動脈縮窄大鼠模型及離體心肌細胞，從整體水平、細胞水平及分子水平分別探討心肌肥大發(fā)生時及其發(fā)生受到L-精氨酸-一氧化氮途徑影響后胞外刺激分子的合成變化、胞內分子信號轉導與核內特異性基因表達模式的改變，從而闡釋病理性心肌肥大與多個信號分子之間的關系以及L-精氨酸-一氧化氮途徑對心肌肥大的作用和相關機制。 1.大鼠腹主動脈縮窄模型的制備及其效果的探討 探討、改進大鼠腹主動脈縮窄模型的制備術式并探究對大鼠腹主動脈的

2、合適縮窄程度。對兩組大鼠分別施行傳統(tǒng)術式與改良術式，然后用改良術式將另外四組大鼠的腹主動脈內徑分別縮窄至0.5mm、0.6mm、0.7mm和0.8mm，對比評價各組的存活率以及造模效果。 結果：顯示：(1) 改良術式組大鼠術后存活率90.00％(27/30)顯著高于傳統(tǒng)術式組66.67％(20/30)；(2) 0.8mm組大鼠存活率86.67％(26/30)顯著高于0.7mm組63.33％(19/30)，0.6mm組43.33％

3、(17/30)及0.5mm組3.33％(1/30)；(3) 0.8mm組與0.7mm組兩組大鼠的平均動脈壓、左心室重量指數(shù)、左心室室壁厚度以及心肌細胞直徑均無顯著性差異。 以上結果證實，采用改良術式將腹主動脈在結扎點處的內徑縮窄至0.8mm，與將其內徑縮窄至0.7mm、0.6mm或0.5mm相比，能在不影響造模效果的前提下，提高大鼠模型的存活率。 2.L-精氨酸-一氧化氮途徑負向調控血管緊張素Ⅱ及其1型受體的表達水平

4、 本實驗利用腹主動脈縮窄的大鼠模型及培養(yǎng)的心肌細胞，從在體和離體水平分別研究心肌內蛋白合成總量與心率、血壓、心肌內一氧化氮(NO)和血管緊張素Ⅱ(ATII)含量的關系，以及NO前體物質L-精氨酸(L-Arg)對上述指標和心肌一氧化氮合成酶(NOS)、血管緊張素轉換酶(ACE)與ATII受體表達的影響，進而探討L-精氨酸對病理性心肌肥大的影響作用及相關機制。 實驗動物分四組：(1) 假手術組；(2) 手術組：按前述方法造成大鼠

5、腹主動脈的機械性縮窄；(3) L-Arg組：腹主動脈縮窄術后即灌飼L-Arg600mg/kg·day-1；(4) L-硝基精氨酸甲酯(L-NAME)組：腹主動脈縮窄術后同時灌飼L-Arg 600mg/kg·day-1及L-NAME 50 mg/kg·day-1。術后6周，測量各組大鼠心率、血壓、左心室重/體重比值、左室心肌蛋白合成總量和NO、ATⅡ的含量以及ACE mRNA的表達量。離體培養(yǎng)的心肌細胞亦分四組：(1)對照組：分離培養(yǎng)乳鼠

6、心肌細胞，無處理因素；(2)ATⅡ組：分離培養(yǎng)心肌細胞72小時后，培養(yǎng)液加入ATⅡ(終濃度0.1μmol/L)；(3)ATⅡ+L-Arg組：分離培養(yǎng)心肌細胞72小時后，培養(yǎng)液同時加入ATⅡ(終濃度0.1μmol/L)和L-Arg(終濃度100μmol/L)；(4)ATⅡ+L-Arg+L-NAME組：分離培養(yǎng)心肌細胞72小時后，培養(yǎng)液同時加入ATⅡ(終濃度0.1μmol/L)、L-Arg(終濃度100μmol/L)和L-NAME(終濃度1

7、5μmol/L)。施加處理因素后48小時，收集各組心肌細胞，檢測NO生成量、誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)mRNA和蛋白水平的表達量，以及ATⅡ的1型受體(ATR1)、2型受體(ATR2)mRNA的表達量。 結果：顯示：(1)L-Arg提高了腹主動脈縮窄大鼠心肌內NO含量，降低了心肌ATⅡ含量、心肌蛋白合成總量、左心室重/體重比值以及ACEmRNA的表達量；L-NAME可消除L-Arg的上述作用；(2)在離體條件下，與ATⅡ組

8、相比，ATⅡ+L-Arg組心肌細胞NO含量、iNOS mRNA及蛋白水平的表達量均有提高，ATR1 mRNA表達水平下降；ATⅡ+L-Arg+L-NAME組與ATⅡ組就上述指標相比無顯著性差異；各組細胞ATR2 mRNA表達水平無明顯差異；(3)多元逐步回歸分析顯示心肌內蛋白合成總量與血壓水平、心率之間均不存在回歸關系，而心肌NO和ATⅡ含量則可作為心肌內蛋白合成總量的預測因子；(4)心肌內ATⅡ含量、ACE mRNA表達量及心肌細胞A

9、TR1 mRNA表達量均與NO含量之間存在線形負相關關系。 以上結果證實：(1)心肌肥大的形成與心肌內NO、ATⅡ含量密切相關；(2)L-Arg通過增強心肌iNOS表達，致NO生成增加。NO可減少心肌內ATⅡ生成，并通過調控心肌ACE及ATR1表達來抑制病理性心肌肥大的形成；(3)ATR2并未參與上述過程。 3.L-精氨酸-一氧化氮途徑抑制絲裂原活化蛋白激酶途徑的磷酸化激活 在離體培養(yǎng)心肌細胞發(fā)生肥大反應時，探討

10、L-精氨酸(L-Arg)對心肌細胞血管緊張素Ⅱ受體(ATR)及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)表達的影響，進而闡明MAPK在心肌肥大發(fā)生中的作用以及L-Arg對心肌細胞肥大反應的影響作用和相關機制。用血管緊張素Ⅱ(ATⅡ)、ATR抑制劑Saralasin、L-Arg和L-NAME(L-硝基精氨酸甲酯)分別作用于心肌細胞，實驗分組：(1) 對照組：無處理因素；(2) ATⅡ組：培養(yǎng)液中加入ATⅡ(終濃度0.1μmol·L-1)；(3) AT

11、Ⅱ+Saralasin組：培養(yǎng)液同時加入ATⅡ(終濃度0.1μmol·L-1)和ATⅡ受體抑制劑Saralasin(終濃度0.1μmol·L-1)；(4) ATⅡ+L-Arg組：培養(yǎng)液中同時加入ATⅡ(終濃度0.1μmol·L-1)和L-Arg(終濃度100μmol·L-1)；(5) ATⅡ+L-Arg+L-NAME組：培養(yǎng)液中同時加入ATⅡ(終濃度0.1μmol·L-1)、L-Arg(終濃度100μmol·L-1)和L-NAME(終濃

12、度15μmol·L-1)。然后以[3H]-亮氨酸摻入法檢測細胞蛋白合成速率、比色法檢測一氧化氮(NO)生成量、RT-PCR及Western blotting檢測ATR及p38 MAPK的表達水平。 結果：顯示：(1)給予L-Arg可緩解ATⅡ引起的心肌細胞NO合成量下降，減弱血管緊張素Ⅱ-1型受體(Angiotensin Receptor Type 1，ATR1)表達及下調p38 MAPK蛋白磷酸化水平，并降低心肌細胞蛋白合成速

13、率；(2)ATR抑制劑Saralasin在降低ATR1表達水平的同時顯著下調p38 MAPK的蛋白磷酸化水平，總P38 MAPK表達水平未見明顯變化；(3)心肌ATR1表達水平及p38 MAPK蛋白磷酸化水平均與NO合成量之間存在線性負相關關系。 以上結果證實：(1) p38 MAPK的磷酸化激活經(jīng)由ATR1介導；(2) L-Arg可致心肌細胞NO合成量增加，后者可抑制ATR1介導的p38 MAPK蛋白磷酸化水平上調，進而抑制心

14、肌細胞肥大反應；(3) ATR2未參與p38MAPK的磷酸化激活過程。 4 L-精氨酸-一氧化氮途徑抑制鈣離子介導的鈣調神經(jīng)磷酸酶途徑的活化 利用急性分離的心肌細胞，探討L-精氨酸對胞內游離鈣離子濃度([Ca2+]i)及鈣調神經(jīng)磷酸酶(CaN)表達的影響，進而闡述CaN途徑在心肌肥大發(fā)生中的作用及其與L-精氨酸-一氧化氮途徑之間的關系。 腹主動脈縮窄的術式及實驗動物分組如前所述：(1) 假手術組：(2)手術組：按

15、前述方法造成大鼠腹主動脈的機械性縮窄；(3)L-Arg組：腹主動脈縮窄術后即灌飼L-Arg 600mg/kg·day-1；(4)L-NAME組：腹主動脈縮窄術后同時灌飼L-Arg 600mg/kg·day-1及L-NAME 50 mg/kg·day-1。6周后，取各組大鼠心臟，利用Bradford法檢測左室心肌總蛋白含量，并以比色法檢測NO生成量。急性分離各組大鼠的心肌細胞，以熒光測定法檢測胞內游離鈣離子濃度：并運用RT-PCR檢測Ca

16、N和胚胎期特異性基因心房利鈉因子(ANF)的表達水平。以胚胎基因ANF表達水平顯著上調作為心肌肥大形成的標志。 結果：證實：(1)心肌細胞內游離鈣離子濃度與CaN的表達水平是參與心肌肥大形成過程的重要因素；(2)L-精氨酸-一氧化氮途徑可顯著降低心肌細胞內的游離鈣離子濃度并下調CaN的表達水平，抑制CaN途徑的活化。 結論： 1.與傳統(tǒng)術式相比，改良術式能夠提高腹主動脈縮窄術后動物模型的存活率。 2.采用

17、改良術式將腹主動脈在結扎點處的內徑縮窄至0.8mm，與將其內徑縮窄至0.7mm、0.6mm或0.5mm相比，能在不影響造模效果的前提下，提高大鼠模型的存活率。 3.心肌肥大的形成與心肌內NO、ATII含量密切相關；L-精氨酸通過增強心肌iNOS表達，致NO生成增加。NO可減少心肌內ATII生成，并通過調控心肌ACE及.ATR1表達來抑制病理性心肌肥大的形成。 4 ATR2未參與ATII和L-精氨酸分別介導的心肌肥大形成與