RhoA-ROCK-2信號通路在VEGF-C促moesin蛋白磷酸化及宮頸癌轉(zhuǎn)移的作用研究.pdf

1、子宮頸癌是全球女性中發(fā)病率僅次于乳腺癌的惡性腫瘤，其發(fā)病率呈升高和低齡化的趨勢?，F(xiàn)有的研究表明，人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是導(dǎo)致子宮頸癌發(fā)生的主要原因。盡管目前針對HPV6，11，16，18型的宮頸癌預(yù)防性疫苗研究取得突破性進(jìn)展，并使得宮頸癌的一級預(yù)防成為可能，但對于現(xiàn)存宮頸癌患者的治療，目前仍有很多問題需要解決。造成子宮頸癌治療困難的主要原因之一即為腫瘤轉(zhuǎn)移(metastasis)。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個

2、多因素、多步驟參與的復(fù)雜的生物學(xué)過程。細(xì)胞遷移(cell migration)為腫瘤組織轉(zhuǎn)移的首要步驟，而細(xì)胞肌動蛋白骨架(actin)的重構(gòu)(reorganization)是細(xì)胞遷移的第一步：肌動蛋白在質(zhì)膜皮質(zhì)層下聚集，伸出偽足(pseudopodia)和突起(protrusion)，與細(xì)胞外基質(zhì)黏附；隨之細(xì)胞借助肌動—肌球蛋白收縮裝置，產(chǎn)生遷移所需的動力，細(xì)胞進(jìn)而移位(translocation)，胞體回縮(retraction)，

3、解除黏附。通過這一循環(huán)往復(fù)的生物學(xué)過程，細(xì)胞完成其動態(tài)的遷移過程。細(xì)胞肌動蛋白骨架重構(gòu)受埃茲蛋白/根蛋白/膜突蛋白(ezrin/radixin/moesin，ERM)家族調(diào)控。Moesin蛋白為該家族的成員之一，集中于富含肌動蛋白的細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)，如微絨毛、板狀偽足等處。在未被激活狀態(tài)下，其N端FERM區(qū)與C端交互作用，自行封閉其與胞膜、肌動蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。細(xì)胞外信號刺激因子可通過改變分子構(gòu)象而激活moesln蛋白，后者作為橋梁分子介導(dǎo)a

4、ctin與質(zhì)膜的交聯(lián)，引發(fā)肌動蛋白骨架的重構(gòu)，從而調(diào)控細(xì)胞生長、遷移。近年來的研究表明，ERM蛋白參與多種婦科腫瘤發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移的過程。我們的前期工作也表明，moesin蛋白高表達(dá)或磷酸化與宮頸癌惡性程度呈正相關(guān)，提示moesin蛋白在宮頸癌的轉(zhuǎn)移過程中起到重要作用。 血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)家族成員對宮頸癌的生長及轉(zhuǎn)移具有重要影響。VEGF—C是VEG

5、F家族的成員之一，其促進(jìn)腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移的作用已引起研究者的重視。大量的研究證實(shí)，產(chǎn)生VEGF—C的腫瘤細(xì)胞具有更高的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。VEGF—C促宮頸癌轉(zhuǎn)移的機(jī)理尚未完全闡明。目前的研究認(rèn)為，VEGF—C與其受體的結(jié)合，可激活絲裂酶原活化蛋白激酶(MPAK)和蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞和淋巴內(nèi)皮的增生和遷移。新生淋巴管和血管在腫瘤生長轉(zhuǎn)移中，為腫瘤組織提供營養(yǎng)物質(zhì)，從而加速腫瘤的轉(zhuǎn)移過程。值得注意的是

6、，在這些機(jī)制之外，VEGF—C也可直接作用于腫瘤細(xì)胞本身，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動和遷移能力。如有研究報(bào)道，在培養(yǎng)的卡波濟(jì)氏肉瘤細(xì)胞株上，可以觀察到VEGF—C促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移，說明在促進(jìn)新生淋巴和血管形成的作用之外，VEGF—C可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞本身的侵襲和遷移能力。我們的前期工作也證實(shí)：VEGF—C可通過促進(jìn)moesin蛋白表達(dá)和磷酸化，引發(fā)宮頸癌細(xì)胞內(nèi)的肌動蛋白骨架重構(gòu)，導(dǎo)致宮頸癌細(xì)胞板狀和絲狀偽足增加，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞株的遷移和侵襲能力。

7、但是，VEGF—C通過何種細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制促進(jìn)moesin蛋白的表達(dá)和磷酸化，尚有待進(jìn)一步證實(shí)。 近來的研究表明，RhoA/ROCK/moesin為一條重要的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與調(diào)節(jié)肌動蛋白細(xì)胞骨架重構(gòu)。在培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞及T47D乳腺癌細(xì)胞上，該通路均可介導(dǎo)moesin蛋白的激活，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的遷移。RhoA為小G蛋白Rho GTP酶家族，這些單體GTP酶與G蛋白一樣，類似分子按鈕在GTP結(jié)合(活化狀態(tài))與GDP結(jié)

8、合狀態(tài)(失活狀態(tài))之間轉(zhuǎn)換，觸發(fā)下游激酶級聯(lián)反應(yīng)而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。ROCK屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員，是目前功能研究最為清楚的Rho下游靶效應(yīng)分子。而最新的文獻(xiàn)報(bào)道顯示，VEGF可通過激活RhoA/ROCK信號通路，介導(dǎo)VEGF促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移的作用。上述的研究背景提示，在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中，VEGF—C也有可能通過激活RhoA/ROCK信號通路，進(jìn)而調(diào)控moesin蛋白的表達(dá)和磷酸化，從而引發(fā)肌動蛋白細(xì)胞骨架的重構(gòu)，提高

9、腫瘤組織細(xì)胞的遷移和侵襲能力。 基于VEGF—C及moesin蛋白在多種腫瘤組織轉(zhuǎn)移中的作用，本研究在前期工作的基礎(chǔ)之上，在組織和細(xì)胞水平觀察VEGF—C對RhoA/ROCK信號的激活作用，并利用ROCK信號的阻斷劑作為工具藥物，探索該信號通路對moesin蛋白表達(dá)和磷酸化的影響，從而明確VEGF—C調(diào)控moesin蛋白的內(nèi)在分子機(jī)制。本研究有利于揭示子宮頸癌轉(zhuǎn)移的內(nèi)在分子機(jī)理，為臨床上開發(fā)出針對宮頸癌患者的全新有效的治療藥物提

10、供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和思路，從而提高宮頸癌患者的治愈率和生存率。 研究目的： 本課題利用臨床上活體取材的不同病理分期的宮頸癌組織標(biāo)本，采用分子生物學(xué)方法，測定不同分期的腫瘤組織中RhoA/ROCK—2信號通路的蛋白表達(dá)量變化。在培養(yǎng)的宮頸鱗癌細(xì)胞株Siha細(xì)胞上，重點(diǎn)從信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面探討VEGF—C通過激活RhoA/ROCK信號通路，調(diào)控moesin蛋白的表達(dá)和磷酸化，并引發(fā)肌動蛋白骨架重構(gòu)及促進(jìn)宮頸癌轉(zhuǎn)移的作用。 研

11、究方法： 1.選取2006年6月1日～2008年8月1日期間中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院首次診治的共33例標(biāo)本，其中12例原位癌(CIN)，11例鱗癌Ⅰ期，10例鱗癌Ⅱ期(未行放化療)作為研究對象。同時取同期因子宮肌瘤行子宮切除的正常宮頸組織10例作為對照。每份標(biāo)本均取材兩份，一份行病理診斷，一份依據(jù)臨床分期分組作為實(shí)驗(yàn)對象。 2.提取正常及上述不同分期的宮頸癌組織蛋白。蛋白定量后利用Western blot技術(shù)測定RhoA/R

12、OCK—2的蛋白含量變化。實(shí)驗(yàn)分組：①正常對照組；②CIN組；③鱗癌Ⅰ期組；④鱗癌Ⅱ期組(未行放化療)。 3.在培養(yǎng)的宮頸癌細(xì)胞株Siha細(xì)胞上，觀察RhoA/ROCK—2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在VEGF—C促moesin蛋白表達(dá)、蛋白磷酸化的作用。實(shí)驗(yàn)分組：①對照組；②VEGF—C處理組；③VEGF—C+ROCK—2特異性抑制劑Y27632組；④VEGF—C+ROCK—2siRNA組。 4.在培養(yǎng)的宮頸癌細(xì)胞株Siha細(xì)胞上，觀

13、察VEGF—C對RhoA/ROCK—2的激活作用。實(shí)驗(yàn)分組：①對照組；②VEGF—C處理組；③VEGF—C+VEGF—C單克隆抗體組； 5.在培養(yǎng)的宮頸癌細(xì)胞株Siha細(xì)胞上，觀察RhoA/ROCK—2在VEGF—C誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移中的作用。實(shí)驗(yàn)分組：①對照組；②VEGF—C處理組；③VEGF—C+VEGF—C單克隆抗體組；④VEGF—C+ROCK—2特異性抑制劑Y27632組；⑤VEGF—C+ROCK—2 siRNA組。

14、 6.統(tǒng)計(jì)方法：定量結(jié)果均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。以SPSS軟件9.0進(jìn)行單因素方差分析(One Way ANOVA)以檢驗(yàn)各組之間差異，P<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 研究結(jié)果： 1.正常組織及宮頸癌組織中RhoA/ROCK—2蛋白的表達(dá)：與正常宮頸組織比較，CIN組織中RhoA/ROCK—2蛋白表達(dá)分別增加了(52±8)％、(64±9)％(n=4，P<0.05)，鱗癌Ⅰ期RhoA/ROCK—2蛋白表達(dá)進(jìn)一步增高(102

15、±16)％、(89±11)％(n=4，P<0.01)，鱗癌Ⅱ期RhoA/ROCK—2蛋白表達(dá)增高更為顯著，其幅度為(186±24)％、(147±21)％(n=4，P<0.001)。 2.在培養(yǎng)的宮頸癌細(xì)胞株Siha細(xì)胞上，VEGF—C作用24 h后，可明顯增加moesin蛋白的表達(dá)和磷酸化，moesin蛋白、P—moesin表達(dá)分別增加了(84±11)％、(106±18)％(n=3，P<0.01)。ROCK—2特異性抑制劑Y23

16、672、ROCK—2抑制性小RNA(siRNA)可抑制VEGF—C對moesin及P—moesin蛋白表達(dá)的上調(diào)作用(n=3，P<0.01)。 3.VEGF—C作用于培養(yǎng)的宮頸癌細(xì)胞株Siha細(xì)胞24 h后，可明顯促進(jìn)RhoA/ROCK—蛋白表達(dá)，其增加幅度為(127±24)％、(86±10)％(n=3，P<0.01)。同時，VEGF—C可促進(jìn)RhoA/ROCK蛋白活性，其增加幅度分別為(144±28)％、(156±23)％(n

17、=3，P<0.01)。VEGF—C單克隆抗體可明顯阻斷VEGF—C促RhoA/ROCK蛋白表達(dá)和活性的效應(yīng)(n=3，P<0.05)。 4.VEGF—C作用于培養(yǎng)的宮頸癌細(xì)胞株Siha細(xì)胞24 h后，可明顯促進(jìn)細(xì)胞遷移。與對照組比較，其遷移數(shù)目增加(122±28)％(n=6，P<0.01)。ROCK—2特異性抑制劑Y23672預(yù)處理細(xì)胞后，可明顯抑制VEGF—C促細(xì)胞遷移的作用，抑制幅度為(64±9)％(n=6，P<0.01)，轉(zhuǎn)