免疫抑制劑處理建立HBV持續(xù)復(fù)制小鼠模型及其免疫學(xué)機(jī)制的研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是全球重要公共衛(wèi)生問題之一;而我國(guó)亦是HBV感染的高發(fā)區(qū)。但是,目前用于慢性HBV感染臨床治療的抗病毒藥物如干擾素和核苷類似物并不能徹底清除HBV。因此,研發(fā)新的藥物和探索新的治療措施是HBV研究領(lǐng)域亟待解決的重要問題。
　　研發(fā)新的抗HBV藥物和探索新的治療措施離不開合適的動(dòng)物模型。為了探索新的免疫調(diào)節(jié)治療策略,模擬免疫抑制或免疫功能損傷的HBV感染者,利用高壓水注

2、射和免疫抑制劑建立HBV持續(xù)復(fù)制的BALB/c小鼠模型,并探索了免疫抑制劑影響HBV復(fù)制的免疫學(xué)機(jī)制。
　　目的：
　　1.分別用不同濃度的地塞米松( Dexamethasome, DEX)、環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide,CYP)、雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)、他克莫司(Tacrolimus, FK506)處理HepG2.2.15細(xì)胞,尋找安全的藥物濃度,并觀察安全藥物濃度下免疫抑制劑對(duì) HBV復(fù)制

3、的影響。
　　2.用免疫抑制劑處理BAL B/c小鼠,6天后給予尾靜脈高壓水注射質(zhì)粒pAAV/HBV1.2(A基因型)建立HBV復(fù)制小鼠模型。監(jiān)測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)小鼠的病原血癥和抗體反應(yīng),分析免疫抑制處理與病毒持續(xù)復(fù)制時(shí)間之間的關(guān)系。
　　3.利用RAPA和生理鹽水分別處理BALB/c小鼠,觀察對(duì)HBV持續(xù)復(fù)制的影響,同時(shí)檢測(cè)各組小鼠免疫應(yīng)答,特別是T細(xì)胞應(yīng)答與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞應(yīng)答水平,通過分析病毒復(fù)制時(shí)間與外周和肝內(nèi)Treg的頻率、

4、T細(xì)胞應(yīng)答的關(guān)系,探索Treg的早期活化對(duì)病毒復(fù)制及T細(xì)胞免疫應(yīng)答的影響,為闡明HBV感染的早期免疫應(yīng)答及其慢性化機(jī)制提供重要的實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.分別用不同濃度地塞米松、環(huán)磷酰胺、雷帕霉素、他克莫司的新鮮培養(yǎng)基處理HepG2.2.15細(xì)胞,在第4天培養(yǎng)中止前4小時(shí)加入5g/l的MTT20ul,4小時(shí)后加入二甲亞砜,酶標(biāo)儀讀取OD570nm值;按細(xì)胞存活率大于95％判定此濃度對(duì)細(xì)胞無毒性,確定藥物的安全作用

5、濃度。
　　2.使用上述免疫抑制劑的安全藥物濃度處理HepG2.2.15細(xì)胞,72小時(shí)后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清,觀察免疫抑制劑對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg和HBeAg分泌的影響;提取細(xì)胞內(nèi)DNA,Southern Blot檢測(cè)免疫抑制劑對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞HBV DNA復(fù)制的影響。
　　3.分別用生理鹽水、他克莫司、地塞米松、環(huán)磷酰胺和雷帕霉素處理BALB/c小鼠,再將C57BL/6小鼠的皮瓣移植到 BALB/c小鼠

6、背部,觀測(cè)皮瓣的存活時(shí)間。從而證實(shí)這幾種免疫抑制劑治療能有效抑制機(jī)體的免疫系統(tǒng)進(jìn)而延長(zhǎng)移植皮瓣的存活時(shí)間。
　　4.分別用生理鹽水、他克莫司、雷帕霉素、地塞米松、環(huán)磷酰胺和Anti-asialo GM1抗體處理BALB/c小鼠,并將質(zhì)粒pAAV/HBV1.2由尾靜脈高壓水注射小鼠體內(nèi),建立 HBV復(fù)制的小鼠模型。定期采血,ECLIA檢測(cè)血清內(nèi) HBsAg、HBsAb、HBcAb的水平,同時(shí)抽提血清內(nèi)的HBV DNA,Real-Ti

7、me PCR檢測(cè)血清內(nèi)的病毒滴度。分析不同的免疫抑制劑及NK抗體阻斷對(duì) BALB/c小鼠體內(nèi) HBV復(fù)制的影響。
　　5.分別給 BALB/c小鼠生理鹽水持續(xù)處理、雷帕霉素持續(xù)處理,通過 ELISA和Real-time PCR檢測(cè)血清病原學(xué)指標(biāo)動(dòng)態(tài)變化;在不同的時(shí)間點(diǎn)處死小鼠,采集血清樣本和肝脾并分離肝臟浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞和脾細(xì)胞,用HBs、HBc多肽刺激脾細(xì)胞后,Elispot檢測(cè)分泌 IFN-γ的細(xì)胞頻率;CD4、CD25和Fox

8、P3染色后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) PBMC、脾細(xì)胞及肝臟浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(liver infiltrating lymphocytes,LILs)中調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞(regulatort T cell,Treg)頻率及功能的變化。同時(shí)抽提肝組織和脾細(xì)胞內(nèi)的RNA,Real-Time PCR檢測(cè) CD分子和抗病毒相關(guān)的細(xì)胞因子 mRNA的表達(dá)水平。分析在尾靜脈高壓水注射的急性 HBV復(fù)制小鼠模型中,免疫抑制劑與 HBV復(fù)制持續(xù)時(shí)間之間的關(guān)系,從而探討病

9、毒復(fù)制與 T細(xì)胞應(yīng)答、Treg負(fù)性調(diào)控之間的關(guān)系,為闡明 HBV感染早期免疫應(yīng)答及其慢性化機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。
　　結(jié)果：
　　1.MTT實(shí)驗(yàn)表明幾種免疫抑制劑的安全作用濃度分別為:環(huán)磷酰胺0～1000 ug/ml、地塞米松0～500 ug/ml、他克莫司0～10 ug/ml、雷帕霉素0～0.4 ng/ml、阿德福韋0～1 ug/ml,在上述范圍內(nèi)的濃度對(duì) HepG2.2.15細(xì)胞無毒性,且對(duì)其 HBsAg和HBeAg分

10、泌無影響。
　　2.將 C57BL/6小鼠的皮瓣移植到 BALB/c小鼠中,生理鹽水處理組的皮瓣存活時(shí)間為8.67±1.86天,而他克莫司、地塞米松、雷帕霉素和環(huán)磷酰胺處理組的皮瓣存活時(shí)間明顯延長(zhǎng),分別為21.50±3.09天、21.50±3.09天、20.00±0.71天、21.40±1.52天。
　　3.通過尾靜脈高壓水注射將質(zhì)粒 pAAV/HBV1.2導(dǎo)入 BALB/c小鼠體內(nèi),所有小鼠均能迅速產(chǎn)生較高的抗原血癥和病毒

11、血癥,小鼠注射后第3天左右抗原血癥和病毒血癥達(dá)到最高峰。生理鹽水處理組的病毒血癥和抗原血癥隨后逐漸下降,HBVDNA于4周后完全清除,8周后抗原血癥完全消失。而在免疫抑制劑處理期間,RAPA處理組、DEX處理組和CYP處理組的抗原血癥和病毒血癥均維持在較高的水平。處理停止后,RAPA處理組抗原血癥和病毒血癥緩慢下降,60％的動(dòng)物表達(dá) HBsAg持續(xù)時(shí)間超過6個(gè)月。DEX處理組停止治療后,病毒血癥快速清除,HBsAg的表達(dá)也急劇下降并維持

12、在非常低的水平,60％的動(dòng)物表達(dá) HBsAg持續(xù)時(shí)間超過6個(gè)月。CYP處理組停藥后,病毒血癥和抗原血癥下降緩慢,80％的動(dòng)物表達(dá) HBsAg持續(xù)時(shí)間超過6個(gè)月。Anti-asialo GM1抗體處理組的抗原血癥較低,高壓水注射后第6周 HBsAg完全清除。
　　4.生理鹽水處理組大多數(shù)動(dòng)物能產(chǎn)生 HBsAb和HBcAb;雷帕霉素處理組部分動(dòng)物能產(chǎn)生 HBcAb,無 HBsAb產(chǎn)生;地塞米松和環(huán)磷酰胺處理組均不能產(chǎn)生 HBsAb和H

13、BcAb。
　　5.生理鹽水處理組小鼠血清 HBsAg在高壓水注射后21天清除,HBVDNA在第30天處于檢測(cè)值下限;雷帕霉素處理組小鼠HBsAg和HBVDNA在第30天仍是陽性。
　　6.生理鹽水處理組小鼠外周血單個(gè)核淋巴細(xì)胞中Treg的頻率從高壓水尾靜脈注射后第一天開始升高,形成第一峰值,推測(cè)可能與高壓水尾靜脈注射導(dǎo)致的肝損傷所致;尾靜脈高壓水注射后14天 PBMC Treg的頻率再次達(dá)到峰值;雷帕霉素處理組 PBMC

14、Treg頻率從高壓水注射后第3天開始升高,直到第21天一直保持在相近水平。
　　7.生理鹽水處理組小鼠脾細(xì)胞中Treg頻率在高壓水注射后第10天和20天有升高,第30天恢復(fù)到初始水平。雷帕霉素處理組脾細(xì)胞 Treg頻率在上述3各時(shí)間點(diǎn)均沒有升高。
　　8.生理鹽水處理組小鼠肝臟浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中Treg頻率在高壓水注射后第10天、20天、30天均處于較低水平。雷帕霉素處理組 LIL中Treg頻率在高壓水尾靜脈注射后第10天和第3

15、0天升高。
　　9.高壓水注射后第30天,雷帕霉素處理組動(dòng)物的脾細(xì)胞分泌 IFN-γ的能力較 NS治療組增強(qiáng)。
　　10.雷帕霉素處理抑制小鼠肝組織 CD markers和細(xì)胞因子 CD3, CD4,CD8, IFN-β, FasL, Perforin, TNFα, IFN-γ的表達(dá),卻增強(qiáng) IL10、TGFβ和FoxP3的表達(dá)。
　　11.雷帕霉素處理組病毒持續(xù)復(fù)制,高壓水注射后第30天,所有小鼠肝組織內(nèi)均能檢測(cè)到明

16、顯的HBV復(fù)制。但是在生理鹽水處理組,在高壓水注射后30天肝內(nèi)沒有HBV復(fù)制。
　　結(jié)論：
　　1.地塞米松、環(huán)磷酰胺和雷帕霉素在安全濃度范圍內(nèi)對(duì) HepG2.2.15細(xì)胞無明顯細(xì)胞毒性;且對(duì) HBsAg、HBeAg分泌、HBVDNA復(fù)制無影響;提示上述免疫抑制劑并不具有直接的促進(jìn)或抑制病毒復(fù)制的作用。
　　2.在高壓水注射的BALB/c小鼠模型中,用雷帕霉素、地塞米松和環(huán)磷酰胺處理能明顯延長(zhǎng)小鼠移植皮瓣的存活時(shí)間;明

17、顯延長(zhǎng) HBV的復(fù)制時(shí)間。提示通過上述免疫抑制劑的處理能成功建立免疫抑制劑誘導(dǎo) HBV持續(xù)復(fù)制模型。
　　3.雷帕霉素可能通過 Treg的活化及增強(qiáng)相關(guān)分子的表達(dá)從而導(dǎo)致 HBV復(fù)制的持續(xù)。
　　本研究的創(chuàng)新點(diǎn)：
　　1.以高壓水注射的急性 HBV復(fù)制小鼠模型為背景,利用免疫抑制劑處理,建立免疫抑制劑誘導(dǎo) HBV持續(xù)復(fù)制小鼠模型,很好的模擬了臨床接受免疫抑制劑治療或機(jī)體免疫應(yīng)答受損的HBV感染者中病毒復(fù)制狀態(tài),為研究上

18、述患者的發(fā)病機(jī)制研究及治療措施評(píng)估提供了一個(gè)新的可用的動(dòng)物模型。
　　2.利用急性和慢性 HBV復(fù)制小鼠模型,通過檢測(cè)病毒特異性 T細(xì)胞、Treg及其相關(guān)分子功能在病毒清除或持續(xù)過程中的變化,探索了Teg在 HBV持續(xù)性復(fù)制中的作用。
　　本研究的意義：
　　在急性 HBV復(fù)制的小鼠模型的基礎(chǔ)上,通過免疫抑制劑處理,成功地建立了HBV持續(xù)復(fù)制小鼠模型,為研究 HBV感染的免疫學(xué)應(yīng)答和抗病毒治療提供了方便實(shí)用的小動(dòng)物模型