基于生物發(fā)光成像技術(shù)的淋巴瘤動(dòng)物模型構(gòu)建研究.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 第一部分：慢病毒載體介導(dǎo)螢火蟲熒光素酶基因轉(zhuǎn)染EL4細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：制備穩(wěn)定表達(dá)螢火蟲熒光素酶(luciferase)的小鼠T細(xì)胞白血病/淋巴瘤細(xì)胞系(EL4)，并觀察熒光素酶基因在EL4細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況，在細(xì)胞水平檢測其生物發(fā)光能力。
　　 方法：通過陽離子脂質(zhì)體法將含熒光素酶(Luc)基因和綠色熒光蛋白(GFP)基因的重組慢病毒表達(dá)載體質(zhì)粒pF12-luc2、包裝結(jié)構(gòu)質(zhì)粒

2、pMDLg/pRRE、pRSV-Rev和包膜蛋白質(zhì)粒pMD2.G 四質(zhì)粒系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染入病毒包裝細(xì)胞293T，24h 后在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況，監(jiān)測轉(zhuǎn)染效率。72h 收集病毒上清，濃縮后以MOI ﹦8感染EL4細(xì)胞，在熒光顯微鏡下和應(yīng)用流式細(xì)胞儀(FACS)觀察感染情況。通過流式細(xì)胞分選儀無菌條件下篩選出表達(dá)綠色熒光蛋白的EL4細(xì)胞，進(jìn)行大規(guī)模擴(kuò)增培養(yǎng)并對轉(zhuǎn)染前后的細(xì)胞進(jìn)行生物特性分析和比較。在體外用活體成像技術(shù)(in vi

3、voimaging)評價(jià)其穩(wěn)定發(fā)光能力。
　　 結(jié)果：慢病毒載體的四質(zhì)粒系統(tǒng)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞24h 后在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光蛋白表達(dá)，病毒滴度測定為8.4×10 7TU/ml。感染EL4細(xì)胞后，熒光顯微鏡下觀察到GFP的表達(dá)，F(xiàn)ACS分析轉(zhuǎn)導(dǎo)效率為96.5[％]。篩選轉(zhuǎn)染后的穩(wěn)定克隆并擴(kuò)增細(xì)胞，分析其生物學(xué)特性(形態(tài)，倍增時(shí)間及生長曲線)與EL4細(xì)胞無明顯差異(P>0.05)?；铙w成像系統(tǒng)分析感染后的EL4細(xì)胞釋放的光子量

4、與細(xì)胞數(shù)量成正相關(guān)(R2=0.9896)。
　　 結(jié)論：本研究表明螢火蟲熒光素酶基因已穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入EL4細(xì)胞，并為下一步的生物發(fā)光動(dòng)物模型的構(gòu)建提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 第二部分：生物發(fā)光淋巴瘤動(dòng)物模型的構(gòu)建
　　 目的：采用生物發(fā)光成像技術(shù)監(jiān)測穩(wěn)定高表達(dá)熒光素酶報(bào)告基因的淋巴瘤細(xì)胞在小鼠體內(nèi)生長及轉(zhuǎn)移的情況，為研究血液系統(tǒng)惡性腫瘤提供有用的模型。
　　 方法：體外擴(kuò)增穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白和熒光素酶的小鼠T細(xì)胞

5、白血病/淋巴瘤細(xì)胞(EL4-GFP-luc2)，熒光倒置顯微鏡觀察綠色熒光表達(dá)情況并檢測細(xì)胞熒光素酶活性；C57BL/6小鼠皮下接種EL4-GFP-luc2細(xì)胞，建立皮下移植瘤模型；尾靜脈接種EL4-GFP-luc2細(xì)胞，以建立EL4小鼠實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)移模型；觀察小鼠腫瘤生長能力，小鼠成瘤時(shí)間，死亡時(shí)間等并比較EL4 荷瘤小鼠和EL4-GFP-luc2 荷瘤小鼠致瘤性；分別在接種瘤細(xì)胞后第3d、7d、14d和21d 應(yīng)用NightOWL LB

6、983 Ⅱ活體動(dòng)物可見光成像系統(tǒng)對小鼠進(jìn)行活體成像1 次，觀察腫瘤的生長、分布及轉(zhuǎn)移；解剖小鼠，取發(fā)光陽性組織器官進(jìn)行體外發(fā)光檢測；流式檢測發(fā)光組織的CD3表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：培養(yǎng)24h 后，用熒光倒置顯微鏡觀察，可見幾乎所有EL4-GFP-luc2細(xì)胞發(fā)出明亮的綠色熒光；熒光光度計(jì)檢測結(jié)果顯示，EL4-GFP-luc2細(xì)胞的熒光素酶活性﹥1×10 5RLU；皮下接種組和尾靜脈接種組小鼠成瘤率均為100[％]，皮下接種組小鼠

7、成瘤時(shí)間為14.6±2.0d，兩組小鼠生存時(shí)間分別為23.7±2.4d和22.8±2.7d，并且EL4 荷瘤小鼠和EL4-GFP-luc2 荷瘤小鼠致瘤性無明顯差異；活體生物發(fā)光系統(tǒng)觀察皮下移植瘤，發(fā)現(xiàn)隨腫瘤移植時(shí)間的推移，腫瘤生物發(fā)光信號(hào)增強(qiáng)并且移植瘤體積與熒光光子數(shù)成正相關(guān)(R2=0.9551)；尾靜脈移植小鼠分別在移植后第7d、14d和21d 出現(xiàn)淋巴結(jié)、骨髓、肝和脾轉(zhuǎn)移；組織器官體外發(fā)光檢測證實(shí)了活體體內(nèi)腫瘤的分布及轉(zhuǎn)移；流式檢