肛門失禁動物模型的構建.pdf

1、肛門失禁是持續(xù)性或反復發(fā)作的不能感知腸內(nèi)容物性狀或不能控制腸內(nèi)容物的排出，包括液態(tài)、氣態(tài)、固態(tài)的腸內(nèi)容物，是復雜的、多因素導致的排便功能紊亂，表現(xiàn)為對氣體或糞便控制能力的損害，導致排便次數(shù)增多，常有腹瀉。這些臨床癥狀經(jīng)常導致患者拒絕參與社交活動并嚴重影響患者的日常生活。雖然相繼提出多種手術及非手術治療方式，但各有其局限性與缺點，頑固性肛門失禁仍然是內(nèi)、外科臨床上十分難處理的問題。為此，我們試圖研制出一種制作肛門失禁動物模型的方法，以期望

2、為制作肛門失禁動物模型提供一種新的思路，為治療肛門失禁疾病的研究做好基礎性工作。鑒于國內(nèi)外學者目前采用的造模方法，研制的新造模方法期望達到的目標主要有：①操作簡單，無需昂貴的實驗儀器及實驗試劑，易于推廣；②微創(chuàng)操作，動物死亡率低；③造模效果確切、穩(wěn)定。 根據(jù)既往研究成果，肛門外括約肌在排便節(jié)制中扮演著重要的角色，其支配神經(jīng)為骶神經(jīng)。Cosovic E等研究發(fā)現(xiàn)局部注射高濃度局麻藥物，可使神經(jīng)在1周后出現(xiàn)變性。局麻藥物神經(jīng)損害程度

3、呈濃度依賴性，其濃度愈高，損害程度愈重，直至運動、感覺功能永久性喪失。另外，當藥物濃度達到臨界水平時，局麻藥具有去污劑性質(zhì)，可導致神經(jīng)細胞膜結構破壞，此過程呈不可逆性改變。神經(jīng)局部注射體積分數(shù)0.99乙醇，可導致末梢神經(jīng)阻滯，應用于三叉神經(jīng)痛的治療。基于上訴理論，我們初步探索了一種新的肛門失禁動物模型的制作方法，通過功能性定位肛門外括約肌支配神經(jīng)，局部注射神經(jīng)毒性藥物，選擇性破壞肛門外括約肌支配神經(jīng)，使其效應肌，即肛門外括約肌發(fā)生功能障

4、礙，成功制作出肛門失禁的動物模型。 目的: 基于操作簡單、經(jīng)濟實用、微創(chuàng)操作、造模效果確切穩(wěn)定的理念，研制出一種制作肛門失禁動物模型的新方法，以期望為制作肛門失禁動物模型提供一種新的思路，為治療肛門失禁疾病的研究做好基礎性工作。 方法: 1.實驗動物及分組8月齡健康成年雄性新西蘭兔30只，體質(zhì)量2.0-2.5 kg，普通級飼養(yǎng)。30只新西蘭兔按隨機數(shù)字表隨機平均分為5組，對照組A（n=6），局部注射藥物為

5、生理鹽水，術后8周取局部組織做病理檢查；實驗組B（n=6），局部注射藥物為50g/L羅哌卡因，術后4周取局部組織做病理檢查；實驗組C（n=6），局部注射藥物為50g/L羅哌卡因，術后8周取局部組織做病理檢查；實驗組D（n=6），局部注射藥物為體積分數(shù)0.99乙醇，術后4周取局部組織做病理檢查；實驗組E（n=6），局部注射藥物為體積分數(shù)0.99乙醇，術后8周取局部組織做病理檢查。 2.動物的麻醉本次實驗動物的麻醉均采用30g/L戊

6、巴比妥1ml/kg靜脈注射麻醉。 3.測術前動物麻醉狀態(tài)下肛管內(nèi)靜息壓力（anal canal resting pressure，ARP）固定動物，肛門周圍及骶部脫毛，肛管內(nèi)置入測壓水囊，連接三通管、壓力標定表、壓力電信號轉(zhuǎn)換器、十六道生理信號采集系統(tǒng)PowerLab16/30（ML880）、Dual Bio Amp/Stimulator（ML408），測動物麻醉狀態(tài)下ARP。 4.功能性定位雙側第4薦神經(jīng)并對肛門外括約

7、肌行肌電圖（electromyography，EMG）檢查在離穿刺部位較遠處安置無關電極一枚，與穿刺針及脈沖器連接形成環(huán)路，在肛門外括約肌上置2枚感應電極。將刺激電流開至1.5mA，脈沖頻率1 Hz。在兔骶部捫及骶骨下部，按照第4薦神經(jīng)的解剖部位進行定位穿刺。當與刺激電極相連的穿刺針進針達一定深度，出現(xiàn)與脈沖電流同步的肛門外括約肌收縮運動時，表明穿刺針接近或抵達第4薦神經(jīng)，此時將脈沖電流關至0.5mA，肛門外括約肌仍在收縮運動，表明已刺

8、中第4薦神經(jīng)。記錄電極刺入的位置、方向、深度。調(diào)整刺激電流參數(shù)設置為方波，頻率1Hz，波寬50us，強度5mA。記錄肛門外括約肌的EMG圖形。 5.神經(jīng)周圍注射藥物在維持上述電流刺激及監(jiān)測肛管內(nèi)壓力變化的情況下，于定位好的第4薦神經(jīng)處，回抽無血液，在兩側第4薦神經(jīng)處緩慢注射藥物。A組注射生理鹽水0.5ml；B、C組注射50g/L羅哌卡因0.1ml/kg+腎上腺素（1：250000）；D、E組注射體積分數(shù)0.99乙醇0.5ml+腎

9、上腺素（1：250000）。均分兩側第4薦神經(jīng)處注射。 6.測術后4周麻醉狀態(tài)下B組、D組動物ARP麻醉并固定動物，肛門周圍及骶部脫毛，肛管內(nèi)置入測壓水囊，連接三通管、壓力標定表、壓力電信號轉(zhuǎn)換器、十六道生理信號采集系統(tǒng)PowerLab16/30（ML880）、Dual Bio Amp/Stimulator（ML408），測動物麻醉狀態(tài)下ARP。 7.對術后4周麻醉狀態(tài)下B組、D組動物行肛門外括約肌EMG檢查在離穿刺部位

10、較遠處安置無關電極一枚，與穿刺針及脈沖器連接形成環(huán)路，在肛門外括約肌上置2枚感應電極。將刺激電流開至1.5 mA，脈沖頻率1 Hz。按記錄的電極刺入的位置、方向、深度刺入，觀察肛門外括約肌的運動情況，必要時將電流刺激強度增加至5mA。記錄肛門外括約肌的EMG圖形。 8.測術后8周麻醉狀態(tài)下A組、C組、E組動物ARP麻醉并固定動物，肛門周圍及骶部脫毛，肛管內(nèi)置入測壓水囊，連接三通管、壓力標定表、壓力電信號轉(zhuǎn)換器、十六道生理信號采集

11、系統(tǒng)PowerLab16/30（ML880）、Dual Bio Amp/Stimulator（ML408），測動物麻醉狀態(tài)下ARP。 9.對術后8周麻醉狀態(tài)下A組、C組、E組動物行肛門外括約肌EMG檢查在離穿刺部位較遠處安置無關電極一枚，與穿刺針及脈沖器連接形成環(huán)路，在肛門外括約肌上置2枚感應電極。將刺激電流開至1.5 mA，脈沖頻率1 Hz。按記錄的電極刺入的位置、方向、深度刺入，觀察肛門外括約肌的運動情況，必要時將電流刺激強

12、度增加至5mA。記錄肛門外括約肌的EMG圖形。 10.標本的獲取及處理術后4周處死B組、D組動物，術后8周處死A組、C組、E組動物，解剖分離肛門外括約肌、注射藥物部位第4薦神經(jīng)根及神經(jīng)周圍組織，仔細觀察大體形態(tài)學改變。取肛門外括約肌、神經(jīng)周圍組織置于4%甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋，切片厚度10um，HE染色，于光學顯微鏡下觀察注射藥物部位第4薦神經(jīng)周圍組織、肛門外括約肌組織形態(tài)學變化。取注射藥物部位第4薦神經(jīng)，大小約1.0mm

13、×1.0mm×1.0mm，立即投放至4℃預冷的30g/L戊二醛溶液固定，再放置4℃保存，逐級乙醇脫水，環(huán)氧樹脂包埋，切片厚度60nm，鉛鈾染色，于透射電鏡下觀察第4薦神經(jīng)根細胞超微結構的改變。 11.數(shù)據(jù)讀取和分析肛管內(nèi)測壓及肛門外括約肌EMG檢查結果通過Lab Chart Reader V6.1讀取并分析 12.統(tǒng)計學分析各組手術前、手術后ARP及手術前后ARP差值，以x±S形式表示，應用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進

14、行統(tǒng)計學分析，各組的術前、術后、手術前后ARP差值的比較采用方差分析，組間的多重比較采用LSD檢驗，α=0.05作為差異顯著性水平。各組動物雙側肛門外括約肌支配神經(jīng)術后神經(jīng)EMG檢查EMG改變是否明顯，以計數(shù)資料形式表示，應用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學分析，各組動物EMG改變明顯率的比較采用雙向無序R×c表資料的Fisher確切概率法檢驗。 結論: 1.肛門失禁動物模型構建方法有效局部注射神經(jīng)毒性藥物，選擇性

15、破壞肛門外括約肌支配神經(jīng)，能夠成功制作出肛門失禁動物模型； 2.肛門失禁動物模型穩(wěn)定性好在術后8W時，實驗組動物仍符合肛門失禁診斷標準，結合病理檢查結果，肛門失禁動物模型穩(wěn)定； 3.操作簡單，易于推廣本課題選用的實驗試劑及儀器設備均為實驗室常用試劑及儀器設備，易于推廣。采用神經(jīng)定位方式，準確、完整地破壞支配肛門外擴約肌的神經(jīng)主干，迅速使肛門外擴約肌癱瘓，達到構建肛門失禁動物模型的目的，操作過程簡單易行； 4.微創(chuàng)