東方巴貝斯蟲頂質(zhì)體基因組的測(cè)序分析及RON2在入侵中作用的研究.pdf

1、東方巴貝斯蟲(Babesia orientalis)是牛的巴貝斯蟲病中比較特殊的一個(gè)血液原蟲蟲種，其僅感染水牛的紅細(xì)胞，由鐮形扇頭蜱經(jīng)卵傳播。在我國長江以南多省份均有流行，患病動(dòng)物常出現(xiàn)黃疸、高熱、貧血和血紅蛋白尿等癥狀，嚴(yán)重時(shí)甚至死亡，對(duì)我國的水牛養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。現(xiàn)階段對(duì)于東方巴貝斯蟲的基因組信息所知有限，入侵相關(guān)機(jī)制的研究也鮮有報(bào)道。
　　基于此，本研究一方面克隆并注釋了東方巴貝斯蟲的頂質(zhì)體基因組DNA序列，并對(duì)其總

2、體的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了詳細(xì)的比對(duì)分析;另一方面，釣取了東方巴貝斯蟲棒狀體頸部蛋白2(RON2)基因信息，對(duì)RON2與AMA1的相互作用進(jìn)行了初步研究。
　　(1)B.orientalis頂質(zhì)體基因組的測(cè)序分析
　　對(duì)于頂質(zhì)體基因組，根據(jù)基因組測(cè)序的高通量測(cè)序序列和cDNA文庫釣取的部分頂質(zhì)體DNA序列，結(jié)合NCBI公布的頂復(fù)門血液原蟲頂質(zhì)體DNA序列，選擇其保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，克隆東方巴貝斯蟲頂質(zhì)體DNA全長。測(cè)序結(jié)果用軟件進(jìn)行拼接

3、，Artemis做注釋。結(jié)果表明，東方巴貝斯蟲頂質(zhì)體基因組全長33200bp的環(huán)狀分子，AT含量在78.9％，包含1個(gè)核糖體大亞基(LSU)、1個(gè)核糖體小亞基(SSU)，38個(gè)編碼蛋白的開放讀碼框以及24個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)。其中38個(gè)ORF包括4個(gè)DNA依賴的RNA合成酶小亞基（rpoB、rpoC1、rpoC2a、rpoC2b）、17個(gè)核糖體蛋白、1個(gè)翻譯延長因子（tufA）、2個(gè)Clp分子伴侶基因以及14個(gè)大小功能未知的假定蛋白

4、。進(jìn)一步對(duì)所獲得的東方巴貝斯蟲頂質(zhì)體基因組DNA與NCBI上有報(bào)道的相關(guān)頂復(fù)門寄生蟲作了詳細(xì)的比對(duì)分析，綜合的結(jié)果表明東方巴貝斯蟲頂質(zhì)體基因組從基因組大小，基因種類，基因結(jié)構(gòu)，基因排列順序，基因進(jìn)化分析等一系列特征上都與牛巴貝斯蟲的頂質(zhì)體最為接近。
　　(2)棒狀體頸部蛋白R(shí)ON2和AMA1基因的相互作用
　　根據(jù)NCBI上公布的頂復(fù)門寄生蟲的RON2序列及部分假定蛋白序列和東方巴貝斯蟲基因組測(cè)序獲得的部分序列，設(shè)計(jì)引物克隆

5、東方巴貝斯蟲棒狀體頸部蛋白2(RON2)基因，獲得的測(cè)序結(jié)果全長為4035bp，本研究選取了RON2與AMA1有相互作用的功能域進(jìn)行截短表達(dá)，分別設(shè)計(jì)特異性引物克隆BoRON2-2、BoRON2-5，構(gòu)建GST標(biāo)簽原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-KG-RON2-2、pGEX-KG-RON2-5，高效表達(dá)。用純化后的RON2-2、RON2-5重組蛋白進(jìn)行Far-western實(shí)驗(yàn)，以及和AMA1蛋白的粘附ELISA實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，重組表達(dá)的RON2