東方巴貝斯蟲TRAP2基因的克隆表達及其部分功能研究.pdf

1、東方巴貝斯蟲(Babesia orientalis)是1984年新發(fā)現(xiàn)并證實的巴貝斯蟲新種，臨床研究表明其僅僅對水牛有較嚴重的致病性，并由鐮形扇頭蜱經(jīng)卵傳遞，主要分布在我國長江以南的區(qū)域?；疾游锱R床表現(xiàn)為貧血、高熱、黃疸和血紅蛋白尿等癥狀，嚴重時會導(dǎo)致死亡，對我國南方農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和水牛養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重威脅。當(dāng)前，水牛巴貝斯蟲病的防治還是傳統(tǒng)的用藥物涂抹防治，治療效果很不理想，而臨床用于防控治療東方巴貝斯蟲病疫苗鮮有報道，對蟲體侵染宿主相關(guān)的

2、關(guān)鍵分子研究也不系統(tǒng)。
　　基于此，本研究選取已經(jīng)在頂復(fù)門類原蟲中確定的關(guān)鍵入侵分子TRAP蛋白為研究對象，從現(xiàn)有的東方巴貝斯蟲基因庫里釣取了東方巴貝斯蟲凝血酶敏感素相關(guān)無名蛋白2(Babesia orientalis Thrombospondin-related anonymous protein2，BoTRAP2)基因信息并進行克隆與分析，并探索了BoTRAP2蛋白與水牛紅細胞膜蛋白的互作，BoTRAP2蛋白及其結(jié)構(gòu)域在與肝素

3、的結(jié)合時的功能特點，最后對BoTRAP2蛋白晶體的形成也進行了嘗試。
　　(1)東方巴貝斯蟲TRAP2基因的克隆、表達和生物信息學(xué)分析
　　通過序列比對在東方巴貝斯蟲全基因庫中查找到了一段和牛巴貝斯蟲TRAP2基因序列(XM_001609762.1)同源性極高的序列。設(shè)計特異性的引物在東方巴貝斯蟲全基因庫中擴增到一條2817bp的片段，對該核苷酸序列進行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其含有2段vWFA結(jié)構(gòu)域、2段TSP結(jié)構(gòu)域、1段MI

4、ADS結(jié)構(gòu)性域、1段橫跨膜結(jié)構(gòu)域，與典型的TRAP樣家族核苷酸結(jié)構(gòu)非常吻合，表明該基因序列為東方巴貝斯蟲TRAP2基因。同源性分析表明該氨基酸序列與牛巴貝斯蟲TRAP2氨基酸序列的同源性高達94％，生物信息學(xué)軟件分析表明該蛋白具有很好的抗原性。
　　(2)東方巴貝斯蟲TRAP2蛋白和紅細胞膜蛋白的相互作用
　　選取TRAP2蛋白的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域（含有vWFA、TSP、MIADS關(guān)鍵序列區(qū)域）進行截短表達，設(shè)計含有合適酶切位點特異

5、性的引物克隆TRAP2-vWFA-TSP，構(gòu)建含單一His標(biāo)簽的原核表達質(zhì)粒pET-28a-TRAP2-vWFA-TSP，轉(zhuǎn)入BL21表達菌株中。經(jīng)過探索，在18℃、100rpm、IPTG濃度1.0mM、培養(yǎng)15h能得到高效表達在上清液的蛋白，通過鎳柱純化能獲得高純度的目的蛋白。Far-western驗證重組TRAP2-vWFA-TSP蛋白與紅細胞膜蛋白的互作，結(jié)果顯示在紅細胞膜蛋白上有一條疑似目的條帶，表明東方巴貝斯蟲TRAP2蛋白與

6、紅細胞膜表面的某一蛋白有一定的結(jié)合作用。
　　(3)東方巴貝斯蟲TRAP2蛋白及其結(jié)構(gòu)域和肝素的粘附結(jié)合
　　分別構(gòu)建pET-28a-TRAP2-vWFA-TSP、pET-28a-TRAP2-vWFA、pET-28a-TRAP2-TSP原核表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入BL21表達菌株中，經(jīng)過探索，獲得了大量高純度的重組TRAP2-vWFA-TSP、TRAP2-vWFA、TRAP2-TSP蛋白，通過ELISA驗證TRAP2蛋白及其結(jié)構(gòu)域與肝

7、素的相互作用。結(jié)果顯示TRAP2蛋白及其結(jié)構(gòu)域與肝素都有很好的結(jié)合，并且TRAP2-vWFA-TSP蛋白與肝素的結(jié)合親和力強于單獨的TRAP2-vWFA、TRAP2-TSP蛋白與肝素結(jié)合的親和力之和，這也表明了在TRAP2蛋白與肝素結(jié)合時其單個結(jié)構(gòu)域可能起著協(xié)同作用。
　　(4)東方巴貝斯蟲TRAP2蛋白晶體的初篩
　　將純化后的截短pET-28a-TRAP2-vWFA-TSP蛋白用型號為GE Superdx200pg分子篩

8、純化柱再次純化，依據(jù)分子篩的運行圖得知pET-28a-TRAP2-vWFA-TSP蛋白以二聚體復(fù)合物的形式存在，經(jīng)過分子篩純化濃縮后能得到蛋白濃度為9mg/mL、純度＞90％的目的蛋白，經(jīng)過商業(yè)化結(jié)晶板進行初篩得到疑似蛋白晶體的小晶塊，通過改變Buffer緩沖液中的鹽離子、沉淀劑的濃度來進行優(yōu)化，實驗未得到理想的結(jié)果，需要進一步摸索條件。
　　本課題成功克隆了東方巴貝斯蟲的TRAP2基因并進行了生物信息學(xué)分析，利用原核表達系統(tǒng)表達