東方巴貝斯蟲cDNA文庫構建及其應用.pdf

1、東方巴貝斯蟲是一種經鐮形扇頭蜱傳播的重要血液原蟲，是由本實驗室發(fā)現(xiàn)和命名的一個巴貝斯蟲新種，主要引起水牛巴貝斯蟲病。該病在我國長江以南許多省份發(fā)生和流行，臨床上患病牛以高熱、貧血、黃疸和血紅蛋白尿等為特征，甚至引起死亡，造成重大的經濟損失。 本研究首先進行了 B.orientalis的分子分類學研究，在此基礎上建立了B.orientalis的半巢式PCR診斷方法，然后構建了 B.orientalis cDNA文庫，以該文庫為基礎

2、，進行了B.orientalis EST序列的測定和分析，并進一步克隆和原核表達了東方巴貝斯蟲熱休克蛋白70(HSP70)基因。 (1)B.orientalis分子分類學研究利用真核生物18S rRNA通用引物擴增了B.orientatis 18S rRNA基因。測序后BLAST 分析表明該蟲種屬巴貝斯蟲。將該基因1，700 bp長片段序列與 GenBank中15種已知巴貝斯蟲的相應序列進行比較分析，建立系統(tǒng)發(fā)育樹。結果表明，B

3、.orientalis 與南非未定種的巴貝斯蟲親緣關系最近，與羊巴貝斯蟲親緣關系較近，與牛巴貝斯蟲、雙芽巴貝斯蟲的親緣關系較遠。這一結果從分子生物學上進一步證實了東方巴貝斯蟲是一獨立種。 (2)B.orientalis半巢式PCR診斷方法的建立與應用根據 B.orientalis 18S rRNA基因V<,4>多變區(qū)設計引物，建立了檢測 B.orientalis的半巢式PCR，特異性擴增 B.orientalis 18S rRN

4、A基因257 bp的片段，敏感性試驗表明其敏感性達到0.00000012％。運用建立好的半巢式PCR 與傳統(tǒng)的姬姆薩染色顯微鏡檢的方法對湖北長江以南4個巴貝斯蟲病疫區(qū)121份水牛血樣，385份鐮形扇頭蜱樣品及湖北長江以北3個巴貝斯蟲病非疫區(qū)71份水牛血樣進行了檢測，檢測結果為：湖北長江以南4個疫區(qū)，血液樣品鏡檢5份陽性，半巢式PCR 24份陽性，蜱的樣品半巢式 PCR 35份陽性；湖北長江以北3個非疫區(qū)鏡檢梨形蟲17份陽性，半巢式PCR

5、 未檢測到陽性樣品。針對上述檢測結果，利用18S rRNA通用引物擴增非疫區(qū)的17份陽性模板，測序后分析均為泰勒蟲。實驗結果表明：本試驗建立的 B.orientalis 半巢式PCR檢測方法具有很高的特異性和敏感度，是一個快速有效的檢測方法。從流行病學調查的結果顯示：B.orientalis 在湖北長江以南廣泛分布，流行嚴重。 (3) B.orientalis cDNA文庫的構建利用E.Z.N.A<'TM>Blood RNA K

6、it提取純化的紅細胞期B.orientalis的總RNA，利用SMART<'TM> cDNA Library Construction Kit反轉錄合成cDNA第一鏈，LD-PCR擴增長片段 cDNA，連接λTriplEx2噬菌體載體，利用Gigapack Ⅲ Gold Packaging Kit體外包裝，構建了B.orientalis cDNA文庫。對原初文庫及擴增文庫的質量和滴度的監(jiān)測表明：文庫的插入片段在0.5～3.0 kb之間，

7、藍白斑實驗表明其重組率約98.8％，原初文庫的滴度為 2.0x10<'6> pfu/mL，擴增文庫的滴度為5.8x10<'8>pfu/mL。結果表明：成功的構建了B.orientalis cDNA文庫。利用制備的抗B.orientalis 兔血清對構建好的B.orientalis cDNA文庫進行免疫學篩選，篩選到3個強陽性克隆子。測序后BLAST分析分別為：B.orientalis熱休克蛋白70(HSP70)基因，核動蛋白基因及功能未

8、知的假定蛋白基因。 (4) B.orientalis EST序列的測定及分析從B.orientalis cDNA文庫中隨機挑取噬菌斑，轉染BW25.8，經PCR鑒定后送插入片段大于300 bp的陽性克隆子測序，共測定了324條B.orientalis EST序列，對有效EST 序列運用phrap等軟件進行拼接，聚類后BLAST 分析，得到46個同源性較高的unigene，這些基因分別為：類紅細胞表面抗原、類裂殖體表面抗原、代謝相

9、關的磷酸酶及蛋白酶、核糖體蛋白、熱休克蛋白70、類熱休克蛋白90、肌動蛋白、鋅指蛋白等基因的部分或全基因及功能未知的假定蛋白基因部分或全基因。 (5) B.orientalis HSP70基因的克隆與原核表達根據 EST 測序的結果，設計一對特異性擴增B.orientalis HSP70基因開放性讀碼框(ORF)的引物，克隆了B.orientalis HSP70的ORF全長基因，構建原核表達質粒 pGEX-KG-HSP70，在E

10、.coli BL21-CodonPlus中實現(xiàn)了高效表達，表達產物經Western-blot檢測分析，結果表明原核表達的HSP70具有較強的免疫反應原性。 本研究對B.orientalis的分子分類學研究，從分子水平證實了B.orientalis是一獨立的新種。建立的半巢式PCR診斷方法，解決了目前水牛巴貝斯蟲病不易準確診斷的難題，對水牛巴貝斯蟲病的臨床診斷、流行病學調查等具有重要意義。本研究構建的B.orientalis的cD