田鼠巴貝斯蟲兩個硫氧還蛋白基因的克隆及鑒定.pdf

1、巴貝斯蟲病是由巴貝斯蟲寄生在宿主紅細胞中引起的一種血液寄生蟲病，主要通過硬蜱傳播。田鼠巴貝斯蟲（Babesia microti）感染動物和人，主要癥狀為發(fā)熱、頭痛、疲勞、貧血等，對免疫缺陷和免疫力低下的人群具有致死性，嚴重危害人類健康，是一種新發(fā)蜱傳疾病。硫氧還蛋白(thioredoxin，Trx)是一種廣泛存在于原核生物和真核生物中的小分子蛋白質(zhì)，它和硫氧還蛋白還原酶(thioredoxin reductase，TrxR)、NADPH

2、共同構(gòu)成了硫氧還蛋白系統(tǒng)，是硫氧還蛋白系統(tǒng)的重要組成部分。對瘧原蟲等血液原蟲的研究發(fā)現(xiàn)，它們生存依賴氧化還原系統(tǒng)清除體內(nèi)的氧化物，硫氧還蛋白系統(tǒng)發(fā)揮著氧化還原調(diào)節(jié)和抗氧化防御的核心功能。目前，巴貝斯蟲硫氧還蛋白系統(tǒng)還缺少研究。本研究旨在鑒定田鼠巴貝斯蟲Trx分子，為了解巴貝斯蟲的硫氧還蛋白系統(tǒng)分子機制，發(fā)現(xiàn)藥物靶點提供基礎。
　　本研究結(jié)果包括以下4個方面:
　　一、通過田鼠巴貝斯蟲轉(zhuǎn)錄組測序，利用生物信息學軟件比對分析，篩

3、選出田鼠巴貝斯蟲硫氧還蛋白(Trx)基因序列。通過3'和5'RACE技術(shù)克隆全長田鼠巴貝斯蟲Trx-2和Trx-3基因。氨基酸序列分析顯示，田鼠巴貝斯蟲Trx-2和Trx-3基因都具有典型的硫氧還蛋白結(jié)構(gòu)域和WCGPC活性位點。
　　二、構(gòu)建了以pET-30a為載體的重組表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細胞，在1mM IPTG誘導下，成功進行了重組蛋白的表達，經(jīng)親和層析純化，獲得重組蛋白。
　　三、胰島素還原實驗顯示，重組Tr

4、x-2和Trx-3蛋白都有還原活性。Trx-2還原活性隨反應時間增加不斷增大，4分鐘后達到平穩(wěn)峰值;Trx-3還原活性迅速，即刻達到平穩(wěn)峰值，與陽性對照組相似。
　　四、通過Western blot鑒定，證明蟲體Trx-2和Trx-3天然蛋白的分子量大小分別為15.5kDa和21.7kDa，且蟲體在紅細胞中分裂高峰期時Trx-2和Trx-3大量表達。間接免疫熒光實驗(IFAT)證明Trx-2和Trx-3天然蛋白主要存在于細胞漿中。