東方巴貝斯蟲(chóng)3個(gè)免疫相關(guān)基因的克隆表達(dá).pdf

1、東方巴貝斯蟲(chóng)(Babesiao rientalis)是一種寄生于水牛紅細(xì)胞內(nèi)，由鐮形扇頭蜱經(jīng)卵傳播的血液原蟲(chóng)，只引起水牛巴貝斯蟲(chóng)病。該病主要分布在中國(guó)長(zhǎng)江以南，主要臨床癥狀為發(fā)熱、貧血、黃疸、血紅蛋白尿，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致死亡，給我國(guó)水牛養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大損失。盡管對(duì)東方巴貝斯蟲(chóng)的體外培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)、傳播媒介、分子分類(lèi)學(xué)和診斷方法等有了一定的認(rèn)識(shí)，但對(duì)其入侵機(jī)制還不了解，缺乏有效的抗原用于免疫診斷和預(yù)防。本研究在建立了東方巴貝斯蟲(chóng)cDNA文庫(kù)的基礎(chǔ)

2、上，通過(guò)免疫篩選挑選3個(gè)可能與免疫相關(guān)的基因，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，原核或真核表達(dá)及免疫原性研究。
　　(1)B.orientaliscDNA文庫(kù)的免疫篩選
　　用東方巴貝斯蟲(chóng)陽(yáng)性的水牛血清對(duì)東方巴貝斯蟲(chóng)裂殖子cDNA文庫(kù)進(jìn)行免疫篩選，挑選其中3個(gè)可能與免疫相關(guān)的基因:BoP34、BoP21和AMA1，對(duì)其進(jìn)行克隆測(cè)序和生物信息學(xué)分析。
　　BoP34基因的核苷酸序列全長(zhǎng)為1088bp，包含兩個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)，

3、編碼251個(gè)氨基酸，蛋白分子量約為34kDa。BLAST分析表明，BoP34與牛巴貝斯蟲(chóng)核移動(dòng)蛋白(XM001611335)核苷酸序列的相似性為72％，證明其為東方巴貝斯蟲(chóng)的核動(dòng)蛋白基因。
　　BoP21基因的核苷酸序列全長(zhǎng)為732bp，包含一個(gè)579bp的ORF，編碼192個(gè)氨基酸，蛋白分子量約為21kDa。BLAST分析表明，BoP21與牛巴貝斯蟲(chóng)假定蛋白(BAN64167.1)核苷酸序列的相似性為68％，證明其為東方巴貝斯蟲(chóng)

4、的假定蛋白基因。
　　東方巴貝斯蟲(chóng)AMA1基因的核苷酸序列全長(zhǎng)為1803bp，沒(méi)有內(nèi)含子，編碼600個(gè)氨基酸，蛋白分子量約為67kDa。同源性分析表明，該基因與牛巴貝斯蟲(chóng)(GenBank序列號(hào):XP001611043)、雙芽巴貝斯蟲(chóng)(GenBank序列號(hào):ADP02977)、吉氏巴貝斯蟲(chóng)(GenBank序列號(hào):ABD04040)AMA1核苷酸序列的相似性分別為72％、52％和53％。結(jié)構(gòu)分析表明，它具有AMA1基因家族的氨基酸結(jié)構(gòu)

5、特征，如N端信號(hào)肽，形成二硫鍵的半胱氨酸殘基，含有三個(gè)結(jié)構(gòu)域的胞外域，C端跨膜區(qū)及胞質(zhì)尾域。
　　(2)BoP34、BoP21和AMA1基因的克隆、原核表達(dá)及免疫反應(yīng)原性
　　根據(jù)BoP34、BoP21和AMA1基因的全長(zhǎng)測(cè)序結(jié)果，分別設(shè)計(jì)特異性引物克隆BoP34-ORF2、BoP-ORF和AMA1的結(jié)構(gòu)域Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-BoP34-ORF2、pET-28a-BoP21-ORF和pET-28a-A

6、MA1-DⅠ/Ⅱ/Ⅲ，在E.coliBL21中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)。將純化后的BoP34、BoP21和AMA1蛋白分別免疫日本大耳白兔，制備了抗東方巴貝斯蟲(chóng)BoP34、BoP21或AMA1的多克隆抗體。ELISA結(jié)果表明，制備的BoP34、BoP21和AMA1多克隆抗體效價(jià)分別為100×27，100×27和100×28;Westernblot結(jié)果顯示，BoP34、BoP21和AMA1重組蛋白均可被東方巴貝斯蟲(chóng)陽(yáng)性的水牛血清所識(shí)別，表明此3種蛋

7、白均具有良好的免疫反應(yīng)原性。分別用BoP34、BoP21和AMA1的多抗血清免疫印跡東方巴貝斯蟲(chóng)總蛋白，均看到與目的蛋白大小一致的特異性條帶，表明此3種蛋白均存在于東方巴貝斯蟲(chóng)中。
　　(3)AMA1截短片段的真核表達(dá)
　　根據(jù)AMA1蛋白二硫鍵的位置，將AMA1胞外域劃分為3個(gè)結(jié)構(gòu)域Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，分別克隆結(jié)構(gòu)域Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅰ/Ⅱ、Ⅱ/Ⅲ和Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ，插入Flag標(biāo)簽后將其連接真核表達(dá)載體pT8，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞，