東方巴貝斯蟲3個免疫相關(guān)基因的克隆表達.pdf

1、東方巴貝斯蟲(Babesiao rientalis)是一種寄生于水牛紅細胞內(nèi)，由鐮形扇頭蜱經(jīng)卵傳播的血液原蟲，只引起水牛巴貝斯蟲病。該病主要分布在中國長江以南，主要臨床癥狀為發(fā)熱、貧血、黃疸、血紅蛋白尿，嚴重時導(dǎo)致死亡，給我國水牛養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大損失。盡管對東方巴貝斯蟲的體外培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)、傳播媒介、分子分類學(xué)和診斷方法等有了一定的認識，但對其入侵機制還不了解，缺乏有效的抗原用于免疫診斷和預(yù)防。本研究在建立了東方巴貝斯蟲cDNA文庫的基礎(chǔ)

2、上，通過免疫篩選挑選3個可能與免疫相關(guān)的基因，對其進行生物信息學(xué)分析，原核或真核表達及免疫原性研究。
　　(1)B.orientaliscDNA文庫的免疫篩選
　　用東方巴貝斯蟲陽性的水牛血清對東方巴貝斯蟲裂殖子cDNA文庫進行免疫篩選，挑選其中3個可能與免疫相關(guān)的基因:BoP34、BoP21和AMA1，對其進行克隆測序和生物信息學(xué)分析。
　　BoP34基因的核苷酸序列全長為1088bp，包含兩個開放閱讀框(ORF)，

3、編碼251個氨基酸，蛋白分子量約為34kDa。BLAST分析表明，BoP34與牛巴貝斯蟲核移動蛋白(XM001611335)核苷酸序列的相似性為72％，證明其為東方巴貝斯蟲的核動蛋白基因。
　　BoP21基因的核苷酸序列全長為732bp，包含一個579bp的ORF，編碼192個氨基酸，蛋白分子量約為21kDa。BLAST分析表明，BoP21與牛巴貝斯蟲假定蛋白(BAN64167.1)核苷酸序列的相似性為68％，證明其為東方巴貝斯蟲

4、的假定蛋白基因。
　　東方巴貝斯蟲AMA1基因的核苷酸序列全長為1803bp，沒有內(nèi)含子，編碼600個氨基酸，蛋白分子量約為67kDa。同源性分析表明，該基因與牛巴貝斯蟲(GenBank序列號:XP001611043)、雙芽巴貝斯蟲(GenBank序列號:ADP02977)、吉氏巴貝斯蟲(GenBank序列號:ABD04040)AMA1核苷酸序列的相似性分別為72％、52％和53％。結(jié)構(gòu)分析表明，它具有AMA1基因家族的氨基酸結(jié)構(gòu)

5、特征，如N端信號肽，形成二硫鍵的半胱氨酸殘基，含有三個結(jié)構(gòu)域的胞外域，C端跨膜區(qū)及胞質(zhì)尾域。
　　(2)BoP34、BoP21和AMA1基因的克隆、原核表達及免疫反應(yīng)原性
　　根據(jù)BoP34、BoP21和AMA1基因的全長測序結(jié)果，分別設(shè)計特異性引物克隆BoP34-ORF2、BoP-ORF和AMA1的結(jié)構(gòu)域Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ，構(gòu)建原核表達質(zhì)粒pET-32a-BoP34-ORF2、pET-28a-BoP21-ORF和pET-28a-A

6、MA1-DⅠ/Ⅱ/Ⅲ，在E.coliBL21中實現(xiàn)了高效表達。將純化后的BoP34、BoP21和AMA1蛋白分別免疫日本大耳白兔，制備了抗東方巴貝斯蟲BoP34、BoP21或AMA1的多克隆抗體。ELISA結(jié)果表明，制備的BoP34、BoP21和AMA1多克隆抗體效價分別為100×27，100×27和100×28;Westernblot結(jié)果顯示，BoP34、BoP21和AMA1重組蛋白均可被東方巴貝斯蟲陽性的水牛血清所識別，表明此3種蛋

7、白均具有良好的免疫反應(yīng)原性。分別用BoP34、BoP21和AMA1的多抗血清免疫印跡東方巴貝斯蟲總蛋白，均看到與目的蛋白大小一致的特異性條帶，表明此3種蛋白均存在于東方巴貝斯蟲中。
　　(3)AMA1截短片段的真核表達
　　根據(jù)AMA1蛋白二硫鍵的位置，將AMA1胞外域劃分為3個結(jié)構(gòu)域Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，分別克隆結(jié)構(gòu)域Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅰ/Ⅱ、Ⅱ/Ⅲ和Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ，插入Flag標(biāo)簽后將其連接真核表達載體pT8，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染COS-1細胞，