東方巴貝斯蟲熱休克蛋白20基因克隆表達(dá)及功能研究.pdf

1、東方巴貝斯蟲（Babesia orientalis）是寄生于水牛的一種重要的血液原蟲，以鐮形扇頭蜱（Rhipicephalus haemaphysaloides）為傳播媒介，臨床癥狀為高熱、貧血、黃疸和血紅蛋白尿等，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致水牛死亡。東方巴貝斯蟲病在我國南方許多省份發(fā)生和流行，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)危害。本實(shí)驗(yàn)室通過對(duì)東方巴貝斯蟲的形態(tài)學(xué)、生活史、傳播媒介和分子分類學(xué)等多方面詳細(xì)研究，確立B.orientalis為一新種。近年來，本實(shí)驗(yàn)室致力于

2、B.orientalis分子生物學(xué)研究，對(duì)東方巴貝斯蟲進(jìn)行了全基因組測(cè)序，為研究B.orientalis的功能基因提供了重要途徑。
　　 小分子熱休克蛋白(small heat shock proteins，sHSPs)是分子量大小在12～43kDa，具有保守的約80～100氨基酸組成的α晶狀體蛋白結(jié)構(gòu)域的一類熱休克蛋白亞家族。sHSPs與寄生蟲感染具有重要的關(guān)系，其中小分子熱休克蛋白HSP20影響頂復(fù)門寄生蟲的移行和入侵等過程

3、。巴貝斯蟲的HSP20蛋白非常保守，是一種重要的蟲體抗原，能夠引起特異性T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。本研究通過比對(duì)基因組信息，找出東方巴貝斯蟲HSP20基因片段，對(duì)該基因進(jìn)行克隆和序列分析。隨后對(duì)該基因進(jìn)行表達(dá)，研究東方巴貝斯蟲HSP20蛋白的免疫原性等，具體工作包括以下幾個(gè)方面:
　　 (1)東方巴貝斯蟲HSP20基因的克隆及序列分析通過比對(duì)東方巴貝斯蟲基因組數(shù)據(jù)庫找到與牛巴貝斯蟲HSP20基因(AF331455.1)具有高同源性的序列

4、片段。設(shè)計(jì)引物從東方巴貝斯蟲基因組DNA中擴(kuò)增得到690bp的完整東方巴貝斯蟲HSP20基因(BoHsp20)，其ORF為534bp，編碼177個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)的蛋白序列中具有小分子熱休克蛋白家族保守的α晶狀體蛋白結(jié)構(gòu)域，表明該蛋白為東方巴貝斯蟲小分子熱休克蛋白20(BoHSP20)。BoHSP20序列與牛巴貝斯蟲、雙芽巴貝斯蟲和分歧巴貝斯蟲HSP20序列的同源性分別高達(dá)94％、86％和86％，以此蛋白序列建立的分子進(jìn)化分析表明東方巴貝斯

5、蟲屬于獨(dú)立的巴貝斯蟲新種，且與牛巴貝斯蟲親緣關(guān)系最接近。生物信息學(xué)分析表明，BoHSP20具有良好的抗原性。
　　 (2)東方巴貝斯蟲HSP20的原核表達(dá)、純化及重組蛋白的抗原性本研究克隆到BoHsp20完整的開放閱讀框，將其插入原核表達(dá)載體pET-28a，成功構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-BoHSP20。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21菌株中誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE分析在約20kDa位置有明顯的特異性表達(dá)條帶，與預(yù)期一致

6、，表明得到高效表達(dá)的重組蛋白His-BoHSP20。經(jīng)鎳親和層析柱純化后，得到單一的目的蛋白。用純化后的BoHSP20蛋白與感染東方巴貝斯蟲的水牛血清進(jìn)行Westernblot反應(yīng)，BoHSP20蛋白與陽性牛血清可產(chǎn)生特異性的反應(yīng)條帶，表明該重組蛋白具有良好的抗原性。
　　 (3)東方巴貝斯蟲HSP20的免疫反應(yīng)原性用重組BoHSP20蛋白作為抗原，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)感染東方巴貝斯蟲的水牛血清樣品的抗體水平。結(jié)果表明，在水牛感染后的第16

7、天即可檢測(cè)到東方巴貝斯蟲抗體，抗體水平維持較高值至感染的62天。說明東方巴貝斯蟲HSP20可以誘導(dǎo)體液免疫。
　　 另外，用本研究制備的BoHSP20蛋白的多克隆抗體對(duì)東方巴貝斯蟲進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)。結(jié)果表明，多抗血清能識(shí)別東方巴貝斯蟲蟲體蛋白，特異性熒光分布于整個(gè)蟲體表面。
　　 兩方面實(shí)驗(yàn)表明，東方巴貝斯蟲HSP20蛋白具有良好的免疫反應(yīng)原性，可以誘導(dǎo)宿主的體液免疫反應(yīng)，并且可用于東方巴貝斯蟲的間接免疫熒光檢測(cè)。<

8、br>　　 (4)東方巴貝斯蟲HSP20的分子伴侶活性檢測(cè)本研究發(fā)現(xiàn)，將BoHSP20轉(zhuǎn)入大腸桿菌中大量表達(dá)可以提高菌株在50℃熱激條件下的存活率達(dá)2倍以上。另外，重組BoHSP20可抑制BSA在化學(xué)變性劑作用下的變性聚集。表明東方巴貝斯蟲HSP20蛋白具有分子伴侶活性。
　　 本研究成功克隆了BoHsp20基因，該基因與其他巴貝斯蟲HSP20基因具有高度保守性;并驗(yàn)證了該蛋白具有良好的免疫反應(yīng)原性，可以誘導(dǎo)宿主的體液免疫反應(yīng)