黃連解毒湯對(duì)快速老化模型小鼠海馬蛋白表達(dá)作用的研究.pdf

1、本研究選擇包括六味地黃湯、八味地黃湯、當(dāng)歸芍藥散、調(diào)心方及黃連解毒湯在內(nèi)的幾種功能主治不同的中藥復(fù)方作為工具藥物，以與阿爾茨海默病(AD)具有相似病理特點(diǎn)的快速老化模型小鼠(SAM)P8亞系(SAMP8)為模型，通過(guò)實(shí)驗(yàn)治療并結(jié)合抑制消減雜交、基因芯片和蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)方法從與學(xué)習(xí)記憶或認(rèn)知功能密切相關(guān)的腦區(qū)尋找藥物反應(yīng)基因和蛋白，旨在通過(guò)分析與比較，確定上述中藥復(fù)方發(fā)揮抗AD作用的主要環(huán)節(jié)或靶點(diǎn)，并據(jù)此提出并通過(guò)驗(yàn)證確定一組或幾組AD

2、防治藥物篩選和評(píng)價(jià)的“組合靶標(biāo)”，為新型抗AD藥物篩選和評(píng)價(jià)體系的建立奠定基礎(chǔ)。 本文主要研究?jī)?nèi)容在于，首先應(yīng)用學(xué)習(xí)記憶行為實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證清熱解毒方劑黃連解毒湯對(duì)SAMP8學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用，進(jìn)而應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，觀(guān)察黃連解毒湯作用下海馬這一與AD病理變化及學(xué)習(xí)記憶損害密切相關(guān)腦區(qū)蛋白表達(dá)的變化，并通過(guò)對(duì)其中的差異蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定和生物信息學(xué)分析，初步獲得海馬中的黃連解毒湯反應(yīng)蛋白，為揭示黃連解毒湯作用環(huán)節(jié)或作用靶點(diǎn)提供依據(jù)

3、。同時(shí)通過(guò)與六味地黃湯、八味地黃湯和當(dāng)歸芍藥散進(jìn)行分析與比較，獲得黃連解毒湯與這三個(gè)方劑的共同反應(yīng)蛋白和各自特異性的反應(yīng)蛋白，為抗AD藥物篩選和評(píng)價(jià)“組合靶標(biāo)”的提出和后續(xù)的靶標(biāo)驗(yàn)證工作提供線(xiàn)索。 一、黃連解毒湯對(duì)12月齡SAMP8學(xué)習(xí)記憶行為的影響 本研究以SAMP8作為學(xué)習(xí)記憶障礙模型，通過(guò)Moms水迷宮實(shí)驗(yàn)和跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)觀(guān)察了黃連解毒湯(HLJDT)對(duì)SAMP8空間學(xué)習(xí)記憶能力和被動(dòng)回避能力的影響。Morris水迷宮實(shí)

4、驗(yàn)結(jié)果表明，與同齡SAMRl相比， SAMP8在定位航行實(shí)驗(yàn)中的逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，空間探索實(shí)驗(yàn)中的目標(biāo)穿環(huán)次數(shù)明顯下降，灌胃給予HuDT(2.5g/kg)，連續(xù)2個(gè)月，可明顯縮短SAMP8的逃避潛伏期，并且可明顯提高目標(biāo)穿環(huán)次數(shù)。跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，訓(xùn)練期間SAMP8逃避電擊成功率低于SAMRl，灌胃給予HLJDT后，提高了SAMP8逃避電擊成功率；測(cè)試階段SAMP8的跳臺(tái)錯(cuò)誤次數(shù)高于SAMR1，灌胃給予HLJDT后跳臺(tái)錯(cuò)誤次數(shù)明顯下降

5、。結(jié)果提示SAMP8被動(dòng)回避反應(yīng)能力降低，HUDT對(duì)其具有一定的改善作用。 二、黃連解毒湯對(duì)12月齡SAMP8海馬蛋白表達(dá)的影響 (一)12月齡SAMR1和SAMP8海馬差異蛋白的分離和鑒定 1 SAMR1和SAMP8海馬蛋白表達(dá)譜的建立及差異分析 首先采用雙向凝膠電泳結(jié)合圖像分析技術(shù)觀(guān)察12月齡SAMR1和SAMP8的海馬蛋白表達(dá)譜，結(jié)果表明，與SAMR1相比，SAMP8海馬中表達(dá)存在明顯差異的蛋白點(diǎn)有

6、29個(gè)，其中8個(gè)蛋白點(diǎn)顯著上調(diào)，21個(gè)蛋白點(diǎn)顯著下調(diào)。 2 SAMR1和SAMP8海馬差異蛋白的質(zhì)譜鑒定及生物信息學(xué)分析 選取上述差異蛋白點(diǎn)中的15個(gè)，經(jīng)膠內(nèi)酶切、MALDI-TOF-MS測(cè)定肽質(zhì)量指紋譜、Mascot數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)進(jìn)行蛋白鑒定，結(jié)果表明這15個(gè)蛋白點(diǎn)對(duì)應(yīng)15個(gè)蛋白，且均為已知功能蛋白，其中有3個(gè)蛋白在SAMP8中表達(dá)顯著上調(diào)，12個(gè)蛋白表達(dá)顯著下調(diào)。 利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)上述15個(gè)差異蛋白的功能及相關(guān)信

7、息進(jìn)行檢索，結(jié)果表明，這些蛋白功能可分為以下8類(lèi)，其中不均一核內(nèi)核糖核蛋白K、腺苷酸激酶4和β-微管蛋白3個(gè)蛋白在SAMP8中表達(dá)上調(diào)；其它蛋白，包括α異檸檬酸脫氫酶、ATP合酶、突觸后密度蛋白95、Stathmin蛋白、蛋白酶體β<,4>、肽酰脯胺酰胺順?lè)词疆悩?gòu)酶、泛素結(jié)合酶E、CDCrel-1和Villin2等在SAMP8海馬中表達(dá)下調(diào)。 (二)黃連解毒湯對(duì)SAMP8海馬蛋白表達(dá)的影響 1 黃連解毒湯對(duì)SAMP8海馬

8、蛋白表達(dá)譜的影晌及差異分析 采用雙向凝膠電泳結(jié)合圖像分析技術(shù)觀(guān)察了連續(xù)灌胃給予2.5α/kgHLJDT 2個(gè)月后SAMP8海馬蛋白表達(dá)譜的變化。結(jié)果表明，與SAMP8對(duì)照組比較，給予HUDT后SAMP8海馬中出現(xiàn)明顯差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)共有38個(gè)，其中18個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)顯著上調(diào)，20個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)顯著下調(diào)。 2 黃連解毒湯反應(yīng)蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定及生物信息學(xué)分析 選取14個(gè)給予HUDT后表達(dá)水平具有明顯變化的蛋白點(diǎn)經(jīng)膠內(nèi)酶切

9、、MALDI-TOF-MS測(cè)定肽質(zhì)量指紋譜、Mascot數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)進(jìn)行蛋白鑒定，結(jié)果有13個(gè)蛋白點(diǎn)鑒定獲得了肽質(zhì)量指紋譜，數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)表明它們對(duì)應(yīng)13個(gè)蛋白，其中11個(gè)蛋白為已知功能蛋白，2個(gè)為未知功能蛋白。11個(gè)已知功能蛋白中，有5個(gè)蛋白在給予HLJDT的SAMP8海馬中表達(dá)顯著上調(diào)，7個(gè)表達(dá)顯著下調(diào)；2個(gè)未知功能蛋白給予HLJDT后表達(dá)均下調(diào)。 利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)己知蛋白的功能及相關(guān)信息進(jìn)行了檢索，結(jié)果表明，上述13個(gè)具有明確功

10、能的蛋白可分為5類(lèi)，其中α異檸檬酸脫氫酶、ATP合酶、腺苷酸激酶4、Stathmin 1蛋白及髓細(xì)胞性白血病因子2共5個(gè)蛋白，它們?cè)诠辔附o予HLJDT后的SAMP8海馬中表達(dá)上調(diào)；醛縮酶C、α烯醇酶、不均一核內(nèi)核糖核蛋白H2、septin 11、谷氨酰胺合成酶和磷酸甘油酸變位酶1共6個(gè)蛋白在給予HLJDT的SAMP8海馬中表達(dá)下調(diào)。 三、黃連解毒湯與六味地黃湯、八昧地黃湯和當(dāng)歸芍藥散對(duì)SAMP8海馬蛋白表達(dá)影響的比較 將

11、它們與HUDT的反應(yīng)蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析與比較，旨在從這四個(gè)方劑中尋找它們的共同反應(yīng)蛋白和各自特異的反應(yīng)蛋白。 (一)四方劑的共同反應(yīng)蛋白 對(duì)12月齡SAMP8分別給予LW、BW、DSS及HUDT后獲得的差異蛋白及藥物反應(yīng)蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定和生物信息學(xué)分析，得到四方劑的共同反應(yīng)蛋白共計(jì)14個(gè)，按功能可分為7類(lèi)。 (二)四方劑特異性的反應(yīng)蛋白 上述四個(gè)方劑除了共同的反應(yīng)蛋白之外，還有其特異性的反應(yīng)蛋白。其

12、中HLJDT特異性的反應(yīng)蛋白點(diǎn)按其功能可以分為5類(lèi)。BW特異性的反應(yīng)蛋白為β伴侶素，屬于熱休克蛋白類(lèi)。DSS特異性藥物反應(yīng)蛋白按功能可以分為4類(lèi)。 四、蛋白免疫印跡對(duì)部分差異蛋白的驗(yàn)證 根據(jù)差異蛋白的功能提示，選擇了醛縮酶3，C異構(gòu)體和還原型輔酶I-輔酶Q氧化還原酶，谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶，谷氨酰胺合成酶，酪氨酸蛋白激酶2共5個(gè)蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜鑒定結(jié)果表明，與同齡SAMRl相比，醛縮酶3和C異構(gòu)體蛋白在SAM

13、P8海馬中表達(dá)顯著上調(diào)，給予DSS或HLJDT后它們的表達(dá)水平明顯下調(diào)，給予BW后它們的表達(dá)水平有下調(diào)趨勢(shì)；酪氨酸蛋白激酶2在SAMP8海馬中表達(dá)也顯著上調(diào)，而給予LW或BW后其表達(dá)水平明顯下調(diào)。 五、腺苷酸激酶4(AK4)在SAM海馬中表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化情況 SAM海馬蛋白的雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜鑒定的結(jié)果表明，腺苷酸激酶4(AK4)在2、6及12月齡SAMR1海馬中均未見(jiàn)表達(dá)，而在各個(gè)月齡SAMP8海馬中呈高表達(dá)，提示AK4可

14、能與老化的發(fā)生密切相關(guān)。本研究應(yīng)用免疫印跡實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步觀(guān)察了AK4在2、6、12及18月齡SAMP8海馬中的動(dòng)態(tài)變化情況，并與同齡SAMR1進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示，AK4在2-18月齡SAMP8中呈高表達(dá)，且隨增齡其表達(dá)水平有逐步升高的趨勢(shì)，與此相反，其在SAMR1海馬中的表達(dá)僅出現(xiàn)于18月齡時(shí)，且表達(dá)非常微弱，其余月齡SAMR1均未見(jiàn)表達(dá)。 通過(guò)以上研究，本論文得到以下結(jié)論： 1．與同齡SAMR1相比，SAMP8空間學(xué)習(xí)

15、記憶功能明顯下降，被動(dòng)回避反應(yīng)能力降低，灌胃給予HLJDT可明顯提高SAMP8的空間學(xué)習(xí)記憶能力，對(duì)其被動(dòng)回避反應(yīng)能力也有一定改善作用，說(shuō)明HUDT具有益智作用。 2．12月齡SAMP8和SAMR1海馬中有29個(gè)差異蛋白點(diǎn)，經(jīng)質(zhì)譜鑒定，共鑒定出15個(gè)蛋白，均為已知功能蛋白，它們的功能涉及能量代謝、蛋白合成降解、細(xì)胞骨架組成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。上述差異蛋白可能與SAMP8學(xué)習(xí)記憶功能障礙有關(guān)，可為SAMP8腦老化機(jī)制或防治AD藥物靶標(biāo)的

16、研究提供線(xiàn)索。 3．灌胃給予HLJDT2個(gè)月后SAMP8海馬蛋白表達(dá)變化的蛋白點(diǎn)有38個(gè)，選擇其中14個(gè)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，鑒定出13個(gè)，其中5個(gè)蛋白在給予HLJDT后表達(dá)顯著上調(diào)，8個(gè)蛋白給予HLJDT后表達(dá)顯著下調(diào)。結(jié)果說(shuō)明HLJDT對(duì)SAMP8海馬蛋白的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用，對(duì)這些蛋白的功能進(jìn)行分析和研究有望為揭示HLJDT作用機(jī)理乃至發(fā)現(xiàn)抗AD藥物作用新靶標(biāo)提供線(xiàn)索。 4．比較六味地黃湯、八味地黃湯、當(dāng)歸芍藥散及黃連解毒

17、湯這四個(gè)臨床和實(shí)驗(yàn)藥理學(xué)均證明可有效防治AD的方劑對(duì)SAMP8海馬蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果表明，這四個(gè)方劑既有共同的反應(yīng)蛋白，也有各自特異的反應(yīng)蛋白。共同反應(yīng)蛋白可能是四方劑防治AD過(guò)程中存在的共同或關(guān)鍵作用環(huán)節(jié)或靶點(diǎn)，有望成為抗AD藥物篩選和評(píng)價(jià)“組合靶標(biāo)”的重要組成部分。 5．運(yùn)用蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)對(duì)醛縮酶C、還原型輔酶I-輔酶Q氧化還原酶等五個(gè)差異蛋白的表達(dá)進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果表明，與雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜的結(jié)果基本一致，提示采用雙向電泳