miR-181c在快速老化小鼠海馬組織中的表達(dá)及其靶基因的初步鑒定.pdf

1、目的:阿爾茨海默病(Alzheimer'sDisease，AD)是一種以進(jìn)行性記憶喪失和認(rèn)知功能障礙為主要臨床特征的神經(jīng)退行性疾病。隨著中國(guó)社會(huì)老齡化進(jìn)程的加速，AD的患病率明顯增加，嚴(yán)重影響著老年人的生活質(zhì)量，給個(gè)人、家庭和社會(huì)造成沉重負(fù)擔(dān)。AD的病因和發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，目前尚不完全清楚。研究認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制主要與能量代謝失調(diào)、氧化應(yīng)激損傷、免疫和炎癥反應(yīng)、胰島素抵抗及Tau蛋白過(guò)度磷酸化等有關(guān)。近年來(lái)，異常表達(dá)的miRNA在AD發(fā)病中

2、的作用已成為新的研究熱點(diǎn)。文獻(xiàn)表明，在AD發(fā)病早期，患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)的海馬組織中miRNAs的表達(dá)出現(xiàn)失調(diào)。異常表達(dá)的miRNA可導(dǎo)致其下游的靶蛋白及相關(guān)信號(hào)通路發(fā)生改變。這些變化在AD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但其確切的分子機(jī)制尚不明確。本研究采用基因芯片技術(shù)，對(duì)癡呆模型快速老化小鼠(SenescenceAcceleratedMouse-Prone/8，SAMP8)海馬組織中miRNAs的表達(dá)譜進(jìn)行分析，篩選出與AD發(fā)病相關(guān)的異常

3、miRNAs，并運(yùn)用Real-timePCR技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。通過(guò)生物信息學(xué)軟件分析預(yù)測(cè)異常miRNAs的靶分子，并采用Westernblot、免疫組化和雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究異常miRNA對(duì)其靶蛋白調(diào)控的分子機(jī)制。本研究為闡明miRNAs在AD發(fā)病中的作用以及開(kāi)發(fā)以miRNAs為靶點(diǎn)的相關(guān)藥物提供理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:選擇3月齡、6月齡和9月齡SAMP8小鼠及其同源正常對(duì)照小鼠(SenescenceA

4、ccelerated-ResistantMouse1，SAMR1)作為研究對(duì)象。
　　 2miRNA表達(dá)譜的檢測(cè):采用miRNA基因芯片GeneChip(r)miRNA2.0Array檢測(cè)3月齡SAMP8及正常同齡對(duì)照SAMR1小鼠海馬組織中miRNAs的表達(dá)譜的改變情況，并利用全基因組及代謝途徑數(shù)據(jù)庫(kù)(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes，KEGG)分析異常表達(dá)的miRNAs可能參與的信號(hào)通路。

5、
　　 3差異性表達(dá)miRNA的驗(yàn)證:通過(guò)Real-timePCR驗(yàn)證目標(biāo)miRNA—miR-181c在3月齡SAMP8和同齡對(duì)照SAMR1小鼠海馬組織中的表達(dá);進(jìn)一步通過(guò)Real-timePCR檢測(cè)miR-181c在3月齡SAMR1小鼠腦、心、肝、腎等組織的表達(dá)和3、6、9月齡SAMP8和同齡對(duì)照SAMR1小鼠海馬組織中的表達(dá)及增齡性改變。
　　 4miR-181c的生物功能富集分析:利用GeneOntology(GO

6、)數(shù)據(jù)庫(kù)分析miR-181c可能的生物學(xué)功能。
　　 5靶基因的預(yù)測(cè)及驗(yàn)證:利用TargetScan，PicTar，PITA和miRanda四種靶基因預(yù)測(cè)軟件綜合預(yù)測(cè)miR-181c的靶基因，結(jié)合功能分析篩選出腦衰反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白2（collapsinresponsemediatorprotein2，crmp2）作為目標(biāo)靶基因，并通過(guò)Real-timePCR檢測(cè)3、6、9月齡SAMP8小鼠和正常同齡對(duì)照SAMR1小鼠海馬組織中crm

7、p2mRNA的表達(dá)。
　　 6CRMP2蛋白的表達(dá):通過(guò)Westernblot和免疫組化的方法對(duì)SAMP8和同齡對(duì)照SAMR1小鼠海馬組織中CRMP2靶蛋白進(jìn)行定量和半定量分析，觀察CRMP2蛋白的表達(dá)模式。
　　 7雙熒光素酶實(shí)驗(yàn):通過(guò)構(gòu)建crmp2基因3'UTRs熒光素酶報(bào)告載體，與miR-181c前體序列或抑制物共同轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞，通過(guò)雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)熒光素酶活性。
　　 8統(tǒng)計(jì)方法:所有數(shù)據(jù)

8、采用(x)±s表示。用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用方差分析和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以p＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1miRNA芯片檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常同齡對(duì)照SAMR1相比，SAMP8海馬組織中表達(dá)差異在1.5倍以上的miRNAs有15個(gè)，其中8個(gè)表達(dá)上調(diào)，7個(gè)表達(dá)下調(diào)，且以miR-181c表達(dá)下調(diào)倍數(shù)最高，為3.08倍。這些表達(dá)下調(diào)miRNAs的靶基因可能參與軸突導(dǎo)向、細(xì)胞的增殖與

9、分化和泛素介導(dǎo)的蛋白水解等信號(hào)通路。
　　 2與同齡正常對(duì)照組SAMR1相比，3月齡SAMP8小鼠海馬組織中miR-181c表達(dá)降低，與芯片結(jié)果一致;與正常同齡對(duì)照組SAMR1相比，3月齡和6月齡SAMP8小鼠海馬組織中miR-181c表達(dá)均下降(p＜0.05)，9月齡時(shí)，miR-181c在SAMR1和SAMP8小鼠海馬組織中的表達(dá)無(wú)明顯差異(p＞0.05)。
　　 3miR-181c在小鼠海馬和腦皮質(zhì)中的相對(duì)表達(dá)量明顯

10、高于心臟、肝臟和腎臟組織(p＜0.05)。
　　 4miR-181c的GO分析結(jié)果提示miR-181c可能參與了對(duì)轉(zhuǎn)錄過(guò)程的調(diào)節(jié)、神經(jīng)元分化、神經(jīng)元突觸和軸突的發(fā)育等生物學(xué)過(guò)程。
　　 5Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常同齡對(duì)照組SAMR1相比，3、6和9月齡SAMP8小鼠海馬組織中，軟件預(yù)測(cè)的miR-181c靶蛋白CRMP2及CRMP2磷酸化蛋白的表達(dá)均明顯升高(p＜0.05);3、6和9月齡SAMP8小鼠海

11、馬組織中CRMP2蛋白表達(dá)呈增齡性升高(p＜0.05)。免疫組化結(jié)果顯示，CRMP2蛋白主要表達(dá)在小鼠海馬組織的CA3區(qū)，DG區(qū)和CA1區(qū)幾乎沒(méi)有陽(yáng)性表達(dá)。
　　 6雙熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染miR-181c前體組，熒光素酶活性明顯減低，而轉(zhuǎn)染miR-181c抑制物組熒光素酶活性則顯著增高(p＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1SAMP8小鼠海馬組織中多種miRNAs表達(dá)失調(diào)，可能通過(guò)軸突導(dǎo)向、細(xì)胞的增