miR-181c在快速老化小鼠海馬組織中的表達及其靶基因的初步鑒定.pdf

1、目的:阿爾茨海默病(Alzheimer'sDisease，AD)是一種以進行性記憶喪失和認知功能障礙為主要臨床特征的神經(jīng)退行性疾病。隨著中國社會老齡化進程的加速，AD的患病率明顯增加，嚴重影響著老年人的生活質(zhì)量，給個人、家庭和社會造成沉重負擔。AD的病因和發(fā)病機制十分復(fù)雜，目前尚不完全清楚。研究認為其發(fā)病機制主要與能量代謝失調(diào)、氧化應(yīng)激損傷、免疫和炎癥反應(yīng)、胰島素抵抗及Tau蛋白過度磷酸化等有關(guān)。近年來，異常表達的miRNA在AD發(fā)病中

2、的作用已成為新的研究熱點。文獻表明，在AD發(fā)病早期，患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)的海馬組織中miRNAs的表達出現(xiàn)失調(diào)。異常表達的miRNA可導致其下游的靶蛋白及相關(guān)信號通路發(fā)生改變。這些變化在AD的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，但其確切的分子機制尚不明確。本研究采用基因芯片技術(shù)，對癡呆模型快速老化小鼠(SenescenceAcceleratedMouse-Prone/8，SAMP8)海馬組織中miRNAs的表達譜進行分析，篩選出與AD發(fā)病相關(guān)的異常

3、miRNAs，并運用Real-timePCR技術(shù)進行驗證。通過生物信息學軟件分析預(yù)測異常miRNAs的靶分子，并采用Westernblot、免疫組化和雙熒光素酶實驗技術(shù)研究異常miRNA對其靶蛋白調(diào)控的分子機制。本研究為闡明miRNAs在AD發(fā)病中的作用以及開發(fā)以miRNAs為靶點的相關(guān)藥物提供理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1實驗動物:選擇3月齡、6月齡和9月齡SAMP8小鼠及其同源正常對照小鼠(SenescenceA

4、ccelerated-ResistantMouse1，SAMR1)作為研究對象。
　　 2miRNA表達譜的檢測:采用miRNA基因芯片GeneChip(r)miRNA2.0Array檢測3月齡SAMP8及正常同齡對照SAMR1小鼠海馬組織中miRNAs的表達譜的改變情況，并利用全基因組及代謝途徑數(shù)據(jù)庫(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes，KEGG)分析異常表達的miRNAs可能參與的信號通路。

5、
　　 3差異性表達miRNA的驗證:通過Real-timePCR驗證目標miRNA—miR-181c在3月齡SAMP8和同齡對照SAMR1小鼠海馬組織中的表達;進一步通過Real-timePCR檢測miR-181c在3月齡SAMR1小鼠腦、心、肝、腎等組織的表達和3、6、9月齡SAMP8和同齡對照SAMR1小鼠海馬組織中的表達及增齡性改變。
　　 4miR-181c的生物功能富集分析:利用GeneOntology(GO

6、)數(shù)據(jù)庫分析miR-181c可能的生物學功能。
　　 5靶基因的預(yù)測及驗證:利用TargetScan，PicTar，PITA和miRanda四種靶基因預(yù)測軟件綜合預(yù)測miR-181c的靶基因，結(jié)合功能分析篩選出腦衰反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白2（collapsinresponsemediatorprotein2，crmp2）作為目標靶基因，并通過Real-timePCR檢測3、6、9月齡SAMP8小鼠和正常同齡對照SAMR1小鼠海馬組織中crm

7、p2mRNA的表達。
　　 6CRMP2蛋白的表達:通過Westernblot和免疫組化的方法對SAMP8和同齡對照SAMR1小鼠海馬組織中CRMP2靶蛋白進行定量和半定量分析，觀察CRMP2蛋白的表達模式。
　　 7雙熒光素酶實驗:通過構(gòu)建crmp2基因3'UTRs熒光素酶報告載體，與miR-181c前體序列或抑制物共同轉(zhuǎn)染HEK-293細胞，通過雙熒光素酶檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。
　　 8統(tǒng)計方法:所有數(shù)據(jù)

8、采用(x)±s表示。用SPSS13.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用方差分析和獨立樣本t檢驗進行統(tǒng)計學分析，以p＜0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果:
　　 1miRNA芯片檢測結(jié)果顯示，與正常同齡對照SAMR1相比，SAMP8海馬組織中表達差異在1.5倍以上的miRNAs有15個，其中8個表達上調(diào)，7個表達下調(diào)，且以miR-181c表達下調(diào)倍數(shù)最高，為3.08倍。這些表達下調(diào)miRNAs的靶基因可能參與軸突導向、細胞的增殖與

9、分化和泛素介導的蛋白水解等信號通路。
　　 2與同齡正常對照組SAMR1相比，3月齡SAMP8小鼠海馬組織中miR-181c表達降低，與芯片結(jié)果一致;與正常同齡對照組SAMR1相比，3月齡和6月齡SAMP8小鼠海馬組織中miR-181c表達均下降(p＜0.05)，9月齡時，miR-181c在SAMR1和SAMP8小鼠海馬組織中的表達無明顯差異(p＞0.05)。
　　 3miR-181c在小鼠海馬和腦皮質(zhì)中的相對表達量明顯

10、高于心臟、肝臟和腎臟組織(p＜0.05)。
　　 4miR-181c的GO分析結(jié)果提示miR-181c可能參與了對轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)節(jié)、神經(jīng)元分化、神經(jīng)元突觸和軸突的發(fā)育等生物學過程。
　　 5Westernblot檢測結(jié)果顯示，與正常同齡對照組SAMR1相比，3、6和9月齡SAMP8小鼠海馬組織中，軟件預(yù)測的miR-181c靶蛋白CRMP2及CRMP2磷酸化蛋白的表達均明顯升高(p＜0.05);3、6和9月齡SAMP8小鼠海

11、馬組織中CRMP2蛋白表達呈增齡性升高(p＜0.05)。免疫組化結(jié)果顯示，CRMP2蛋白主要表達在小鼠海馬組織的CA3區(qū)，DG區(qū)和CA1區(qū)幾乎沒有陽性表達。
　　 6雙熒光素酶活性檢測結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染miR-181c前體組，熒光素酶活性明顯減低，而轉(zhuǎn)染miR-181c抑制物組熒光素酶活性則顯著增高(p＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1SAMP8小鼠海馬組織中多種miRNAs表達失調(diào)，可能通過軸突導向、細胞的增