Tap2b基因轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞及其對P38MAPK信號通路的影響.pdf

1、肺癌是威脅人類健康的惡性腫瘤之一，不管是發(fā)病率還是死亡率均位居惡性疾病前列，它的發(fā)生是多基因、多因素、多階段相互作用的結(jié)果。參與肺癌發(fā)生過程的相關(guān)基因在正常組織和肺癌中的表達存在顯著的差異，發(fā)現(xiàn)和研究這些肺癌差異表達基因不但有利于揭示肺癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，而且還可為肺癌的診斷、治療以及預(yù)防提供新的生物標(biāo)志和靶點。
　　 Rap2b基因是最近運用抑制性消減雜交技術(shù)從中國人肺鱗癌高表達文庫中篩選出的一個基因，它是ras癌基因超家族

2、中的一員，并與之高度同源。以往研究顯示多種腫瘤都存在ras的突變及過度表達。Ras基因影響下游效應(yīng)因子多數(shù)是通過絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，P38絲裂原活化蛋白激酶(P38 mitogen-activated protein kinase，P38MAPK)是MAPK家族成員之一。因此，rap2b基因也可能在P38MAPK信號通路中發(fā)揮重要作用。目的

3、　　 該研究通過把pcDNA3.1-rap2b重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，并應(yīng)用P38MAPK特異性抑制劑，以觀察P38MAPK通路下游轉(zhuǎn)錄因子ATF-2的活化情況和rap2b基因在該通路中的作用，為探討rap2b基因在人肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用提供實驗依據(jù)。實驗方法
　　 1.pcDNA3.1-rap2b重組質(zhì)粒及pcDNA3.1空質(zhì)粒的提取用質(zhì)粒提取試劑盒分別提取pcDNA3.1-rap2b重組質(zhì)粒及pcDNA3.1空質(zhì)粒，

4、并進行初步鑒定。
　　 2.重組質(zhì)粒的酶切鑒定對pcDNA3.1-rap2b重組質(zhì)粒分別進行EcoR I單酶切和EcoR I、Xho I雙酶切鑒定，1.0％瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。
　　 3.PCR方法擴增rap2b基因以提取的質(zhì)粒為模板，利用rap2b基因的上下游特異性引物進行PCR擴增，用1.0％瓊脂糖凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進行鑒定，觀察有無rap2b基因目的片段。
　　 4.重組質(zhì)粒的測序鑒定
　　 經(jīng)

5、北京三博生物工程技術(shù)公司采用pcDNA3.1通用引物測定。運用BLAST軟件，將rap2b基因序列與Genebank公布的對應(yīng)序列進行比較分析。
　　 5.轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞將鑒定后去內(nèi)毒素的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞中，48h和72h后分別從核酸和蛋白方面進行鑒定。
　　 6.P38MAPK抑制劑的應(yīng)用轉(zhuǎn)染前1h用P38MAPK抑制劑處理轉(zhuǎn)染細(xì)胞，72h后從蛋白方面進行鑒定。
　　 7.Western-blot

6、以正常細(xì)胞組作為對照，對轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒細(xì)胞組、轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒細(xì)胞組、抑制劑+重組質(zhì)粒細(xì)胞組測定磷酸化的和總的ATF-2蛋白表達，以了解rap2b基因在P38MAPK通路中所起的作用。
　　 結(jié)果：
　　 1.pcDNA3.1-rap2b重組質(zhì)粒的提取與鑒定
　　 挑取單菌落振蕩過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，進行鑒定。結(jié)果顯示，EcoRI單酶切產(chǎn)物長度為5.5kb左右，EcoRI及XhoI雙酶切產(chǎn)物長度分別是5.5kb和0.629

7、kb，和預(yù)期結(jié)果相同。用陽性質(zhì)粒作為模板，用rap2b基因的特異上下游引物進行PCR擴增，擴增出大小為629bp的片段。經(jīng)測序和序列分析，與Genebank公布的對應(yīng)序列同源性為100％，證明是pcDNA3.1-rap2b重組質(zhì)粒。
　　 2.轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞結(jié)果
　　 從細(xì)菌中提取去內(nèi)毒素的質(zhì)粒，用脂質(zhì)體法將其轉(zhuǎn)染進NIH3T3細(xì)胞中，通過RT-PCR進行mRNA的鑒定，擴增的目的條帶與預(yù)期結(jié)果一致；提取蛋白后檢測

8、，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-rap2b質(zhì)粒的細(xì)胞表達RAP2B蛋白，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1質(zhì)粒和空白對照組則沒有表達。
　　 3.Western-blot結(jié)果
　　 對于ATF-2磷酸化蛋白表達，與正常細(xì)胞和轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空質(zhì)粒細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-rap2b重組質(zhì)粒的細(xì)胞表達上調(diào)（P＜0.05），與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-rap2b重組質(zhì)粒的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染抑制劑+pcDNA3.1-rap2b重組質(zhì)粒的細(xì)胞表達下