微囊化轉(zhuǎn)神經(jīng)生長因子基因的NIH3T3細(xì)胞移植促進(jìn)創(chuàng)面愈合的實驗研究.pdf

1、近年來的研究證明，神經(jīng)生長因子(NerveGrowthFactor,NGF)不僅作為促進(jìn)周圍神經(jīng)再生的特殊因子，也是在創(chuàng)面愈合過程中能誘導(dǎo)炎癥細(xì)、促進(jìn)膠原分泌、促進(jìn)表皮組織增生的細(xì)胞因子。但外源性生長因子如何補(bǔ)充仍是當(dāng)前臨床工作面臨的問題之一。這是由于生長因子的半衰期較短，且創(chuàng)面滲出液中含有多種的蛋白水解酶，局部應(yīng)用或物理性緩釋的給藥途徑會受到限制，靜脈給藥不僅用量大、也不能通過機(jī)體的生物屏障?；虔煼ǖ奶岢鰹榻鉀Q這一難題展現(xiàn)了一定的光

2、明前景。經(jīng)過基因工程技術(shù)修飾的靶細(xì)胞，如能移植于創(chuàng)面，使其持續(xù)、穩(wěn)定地分泌所需的生長因子，則能達(dá)到高效、合理地使用生長因子的目的。自體靶細(xì)胞因不存在免疫排斥反應(yīng)理應(yīng)成為最好的選擇，但獲取靶細(xì)胞的同時會給患者造成新的損傷，而且制備周期較長，應(yīng)用價值受限。因此，微囊化基因修飾細(xì)胞移植技術(shù)的出現(xiàn)，為解決此問題提供了迄今為止最佳的手段。如果微囊化基因修飾細(xì)胞能夠長期凍存，則可形成“細(xì)胞銀行”，需要時可即刻復(fù)蘇，做到快捷、高效，可能具有潛在的產(chǎn)業(yè)

3、化前景。微囊移植技術(shù)在我國尚起步不久，仍主要處于實驗研究階段，將微囊技術(shù)用于創(chuàng)面愈合的研究尚未見到報道。本研究利用微囊化細(xì)胞移植技術(shù)具有免疫隔離和長期釋放特定活性物質(zhì)，無需反復(fù)給藥的特點，將該技術(shù)與組織工程技術(shù)、基因工程技術(shù)相結(jié)合，使囊內(nèi)具有分泌NGF功能的NGF-NIH3T3細(xì)胞作為構(gòu)建組織工程皮膚的“種子細(xì)胞”或單獨應(yīng)用，觀察其對急、慢性創(chuàng)面的影響。實驗內(nèi)容和結(jié)果如下： 1.利用構(gòu)建成功的分泌型NGF真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3

4、.1+/NGF，導(dǎo)入NIH3T3細(xì)胞，篩選出穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，應(yīng)用ELISA法檢測細(xì)胞上清中NGF的含量，將上清加入與PC12細(xì)胞培養(yǎng)液中觀察其變化；將此細(xì)胞通過大功率脈沖成囊儀制備成微囊化NGF基因修飾的NIH3T3細(xì)胞，經(jīng)深低溫凍存8周后復(fù)蘇，檢測其破囊率，同時制備粒徑相似的NIH3T3細(xì)胞微囊及空囊，作為對照組備用。結(jié)果：經(jīng)此方法可獲得穩(wěn)定表達(dá)NGF的NIH3T3細(xì)胞株；微囊化后凍存8周復(fù)蘇，囊內(nèi)細(xì)胞仍正常存活，并分泌具有生物活性

5、的NGF(59.44pg/ml)，其破囊率不超過10％。 2.以膠原為基質(zhì)、人成纖維細(xì)胞、角朊細(xì)胞及上述制備好的微囊化NGF-NIH3T3細(xì)胞、NIH3T3細(xì)胞和空囊為種子細(xì)胞，用組織工程皮膚培養(yǎng)系統(tǒng)構(gòu)建微囊復(fù)合組織工程皮膚，應(yīng)用ELISA法檢測培養(yǎng)上清中NGF的含量、堿水解法行羥脯氨酸(HydroxyprolineHyp)含量測定、MTT實驗及流式細(xì)胞儀測定種子細(xì)胞增殖情況、電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果：微囊化NGF-NIH3T3細(xì)

6、胞復(fù)合組織工程皮膚后，可使處于G2期、S期的人角朊細(xì)胞百分比增高(P＜0.05)，體外培養(yǎng)6周，仍穩(wěn)定分泌NGF(124.32pg/ml)，體外培養(yǎng)一周后的組織工程真皮中NGF-NIH3T3微囊組Hyp的含量為69.68±6.20(mg/g組織濕重)，較空白對照組增加約2倍以上P＜0.05)。 3.以豬背部急性全層皮膚缺損為模型，分為微囊化NGF-NIH3T3細(xì)胞復(fù)合真皮(A組)，微囊化NIH3T3細(xì)胞復(fù)合真皮(B組)，空囊復(fù)合

7、真皮(C組)，含NGF(5ng/ml)的膠原膜(D組)移植組以及微囊化NGF-NIH3T3細(xì)胞懸液創(chuàng)面注射(E組)和空白對照組(E組)，觀察各組創(chuàng)面愈合速度、愈合時間、創(chuàng)周組織Hyp含量以及CD4+細(xì)胞免疫組化染色等。結(jié)果：A組平均愈合時間為25±2天，B組為34±3天，C組為34±2天，D組為33±2天，E組為29±4天，F(xiàn)組為40±3天，創(chuàng)面愈合時間顯著加快，同時使創(chuàng)周組織中CD4+細(xì)胞比例增高，促進(jìn)創(chuàng)面炎癥的發(fā)生。 4.制

8、作大鼠背部慢性創(chuàng)面模型，應(yīng)用PKH26細(xì)胞染料標(biāo)記微囊化NGF-NIH3T3細(xì)胞，同實驗3中所述方法分組，觀察各組創(chuàng)面愈合速度及愈合時間，創(chuàng)面組織S-100、α-SMA、Ⅷ因子免疫組化染色，以及創(chuàng)周組織中Hyp含量測定等。結(jié)果：微囊化NGF-NIH3T3細(xì)胞復(fù)合TE真皮法、創(chuàng)面注射法和NGF復(fù)合膠原膜法均可提高創(chuàng)面愈合速度，與對照組相比差異顯著(P＜0.05)。至術(shù)后5周，在創(chuàng)面局部仍可觀察到被PKH26標(biāo)記的微囊化NGF-NIH3T3

9、細(xì)胞發(fā)出的紅色熒光；另外，微囊化NGF-NIH3T3細(xì)胞移植的創(chuàng)面Hyp含量增高，S-100陽性細(xì)胞增多(P＜0.05)，Ⅷ因子表達(dá)增強(qiáng)(P＜0.05)，創(chuàng)周組織中α-SMA陽性細(xì)胞率也較空白對照組增高約2倍，說明創(chuàng)面愈合過程明顯加速，愈合質(zhì)量提高。 通過以上觀察，得出如下結(jié)論： 1.應(yīng)用FuGENETM6法可成功將pcDNA3.1+/NGF質(zhì)粒導(dǎo)入NIH3T3細(xì)胞內(nèi)，獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，此細(xì)胞系經(jīng)擴(kuò)增后微囊化，經(jīng)長途

10、轉(zhuǎn)運(yùn)及深低溫凍存8周后仍具有分泌生物活性的NGF的功能(59.44pg/ml)； 2.在體外首次成功構(gòu)建了微囊化NGF基因修飾NIH3T3細(xì)胞復(fù)合組織工程皮膚，NGF-NIH3T3細(xì)胞可存活，而且能提高組織工程皮膚中原有種子細(xì)胞(成纖維細(xì)胞和角朊細(xì)胞)生物活性，并使組織工程皮膚具有分泌NGF的功能，因而發(fā)揮促進(jìn)周圍Fb和Ep細(xì)胞活性的功能； 3.微囊經(jīng)移植后囊內(nèi)細(xì)胞可在創(chuàng)面局部至少存活5周；4.采用不同的方法將微囊化NG