MicroRNA-1抑制內(nèi)皮素-1表達機制的初步研究.pdf

1、本研究通過對MicroRNA-1和ET-1mRNA時空表達譜檢測和生物信息學預測分析，發(fā)現(xiàn)了MicroRNA-1可能參與調(diào)控ET-1基因表達的多項線索；利用報告基因、預測靶位點序列缺失和突變等功能研究方法，證實了MicroRNA-1能夠通過ET-13'UTR上特定靶序列在轉(zhuǎn)錄后水平抑制內(nèi)源性ET-1基因表達。我們的研究首次發(fā)MicroRNA對心血管活性物質(zhì)的調(diào)控作用，為闡明MicroRNA在心血管生理活動和疾病中的作用提供了新的依據(jù)。

2、 內(nèi)皮素(endothelin，ET)是1988年Yanagisawa等首先從豬的主動脈內(nèi)皮細胞分離純化的一種由21個氨基酸組成的心血管活性多肽，主要分布于心血管系統(tǒng)，是目前已知最強烈的血管收縮物質(zhì)之一。在心臟，ET-1參與了心臟發(fā)育、心肌肥厚、心律失常等生理和病理生理過程。ET-1基因受不同水平的表達調(diào)控，轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控對于ET-1基因表達具有重要意義，ET-1 mRNA 3’非翻譯區(qū)(3’UTR)存在多個富含AU的反應元件(

3、A-U rich element，ARE)，直接影響mRNA的穩(wěn)定性；本課題組前期在大鼠急性缺血性心律失常模型中，采用針對ET-1 mRNA的反義寡核苷酸和ET-1 10-23脫氧核酶，均能有效下調(diào)ET-1基因表達，減少缺血性心律失常的發(fā)生，說明內(nèi)源性調(diào)控機制和外源性干預手段均能夠在轉(zhuǎn)錄后水平影響ET-1基因表達。MicroRNA是近年來在生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性單鏈小分子RNA，長度在19-22核苷酸左右，其序列在物種間高度保守。Mi

4、croRNA通過與靶基因mRNA 3’非翻譯區(qū)(3'UTR)上相應靶序列堿基之間不完全或完全的互補結(jié)合，而抑制mRNA的翻譯或?qū)е耺RNA的降解，進而在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮對靶基因的沉默效應。在生物體中已發(fā)現(xiàn)的microRNA序列多達600余種，參與了包括生物體發(fā)育、腫瘤發(fā)生、炎癥反應、細胞凋亡以及病原體感染等多種生理和病理生理過程。在心血管系統(tǒng)，已有報道MicroRNA參與了心臟發(fā)育、心肌肥厚和心律失常等多種生理和病理生理過程，尤其是一些心

5、臟組織特異性表達的MicroRNA與心臟特殊的生理結(jié)構(gòu)和病理過程密切相關。 在本研究中，我們擬通過檢測分析MicroRNA-1和ET-1 mRNA在組織細胞的表達分布以及在C2C12成肌細胞分化過程中表達變化及其相關性，結(jié)合生物信息學預測，尋找和明確MicroRNA-1參與ET-1基因表達調(diào)控的線索；利用報告基因系統(tǒng)和靶序列缺失突變等MicroRNA功能研究方法，確認MicroRNA-1對內(nèi)源性ET-1基因表達的調(diào)控作用，并對這

6、種調(diào)控作用的機制進行初步研究，為闡明MicroRNA在心臟發(fā)育、心肌肥厚和心律失常等心臟生理和病理生理過程中的功能作用提供新的理論依據(jù)，為心血管疾病防治的提供新的思路和治療策略。 材料和方法： (1)細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：Hela和293T細胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清(Biosource)和100U/ml青鏈霉素(Gibco)的DMEM培養(yǎng)基中，待細胞長滿10cm培養(yǎng)板底面積80％-90％，用0.25％-EDTA胰酶(Gibco

7、)消化細胞后，以每孔1×10<'5>個細胞接種細胞于24孔細胞培養(yǎng)板中，37℃5％CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日用脂質(zhì)體 lipofectamine2000(Invitrogen)轉(zhuǎn)染相應的質(zhì)粒載體。 (2) C2C12小鼠成肌細胞的培養(yǎng)和分化：C2C12培養(yǎng)于含10％胎牛血清和100U/ml青鏈霉素的DMEM生長培養(yǎng)基中，待細胞長滿10cm培養(yǎng)板底面積 70％-80％，用0.25％-EDTA胰酶消化后，以每孔2×10<'5>個

8、細胞接種于12孔細胞培養(yǎng)板中，于37℃5％CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日將生長培養(yǎng)基更換為含2％熱滅活馬血清的DMEM分化培養(yǎng)基，誘導細胞分化。分別收取分化第一、四、六天細胞樣品抽提 RNA，檢測分析MicroRNA-1和ET-1等基因mRNA表達變化。 (3)SYBR Green定量PCR檢測成熟MicroRNA和ET-1等基因mRNA的表達：以小鼠和人組織細胞總RNA為模板，分別利用MicroRNA特異性莖環(huán)結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄(RT

9、)引物、隨機引物和OligodT20作為RT引物進行反轉(zhuǎn)錄，得到MicroRNA、U6剪接體RNA和ET-1等基因mRNA的cDNA模板；利用SYBR Premix Ex Taq酶(TakaRa)和特異性定量PCR引物對MicroRNA、U6和ET-1等基因mRNA相對表達量進行檢測分析 (4)生物信息學預測：利用TargetScan、BiBiserve等MicroRNA靶基因預測網(wǎng)站和軟件，對人ET-13’非翻譯區(qū)(3’UTR

10、)上MicroRNA-1作用的靶序列進行預測分析。 (5)載體構(gòu)建和報告基因檢測：以人臍靜脈內(nèi)皮細胞cDNA為模板利用PCR反應擴增人ET-13'UTR不同區(qū)域片段，將其亞克隆至pGL3質(zhì)粒(Promega)熒光素酶報告基因下游，構(gòu)建表達融合ET-13'UTR的螢光素酶報告基因的pGL3重組載體；以Hela細胞基因組DNA為模板擴增MicroRNA前體序列，將其亞克隆至pSuper質(zhì)粒H1 RNA啟動子下游多克隆位點中，構(gòu)建表達

11、MicroRNA前體的pSuper重組質(zhì)粒。將上述兩種重組載體共轉(zhuǎn)染293T細胞24小時后，用裂解液裂解細胞，采用雙螢光報告基因檢測系統(tǒng)(promega)檢測樣品螢光素酶相對表達量。 (6)MicroRNA靶序列突變：以融合野生型ET-13’UTR的pGL3重組質(zhì)粒為模板，利用靶位點突變引物和高保真酶(TaKaRa)PCR反應，擴增得到靶序列突變的線性化產(chǎn)物，DpNI限制性內(nèi)切酶(Fermentas)消化PCR產(chǎn)物中的質(zhì)粒模板后

12、，在DH5α大腸桿菌中對線性化產(chǎn)物進行同源重組，獲得靶序列突變的環(huán)化pGL3質(zhì)粒，通過測序證實靶序列的突變。 (7)酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)：Hela細胞轉(zhuǎn)染MicroRNA表達載體24小時后，更換無血清DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)孵育24小時后收集細胞培養(yǎng)上清液后，利用人ET-1ELISA試劑盒(R＆D)檢測各實驗組上清液中ET-1蛋白的相對含量，以細胞總蛋白量進行標準化。 結(jié)果： 小鼠和人部分組織細胞中Micr

13、oRNA-1和ET-1 mRNA表達分布和及其相關性：在小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、大腦、骨骼肌和胃腸平滑肌組織中，MicroRNA-1特異性高表達于心臟和骨骼肌組織，其他組織MicroRNA-1的相對表達水平很低；ET-1 mRNA主要表達于肺組織，腎臟、胃腸、大腦和心臟表達相對較低，骨骼肌和肝臟組織ET-1 mRNA表達量很低。在人心臟、骨骼組織以及Hela、293T和人臍靜脈內(nèi)皮細胞中，MicroRNA-1在心臟和骨骼肌中特

14、異性高表達，在其他三種細胞中表達量很低；ET-1 mRNA在內(nèi)皮細胞中表達量最高，在Hela細胞和心臟組織表達相對較低，在骨骼肌和293T細胞表達量很低。綜合上述結(jié)果： MicroRNA-1和ET-1 mRNA在組織細胞表達分布上存在一定負相關性，提示ET-1可能是MicroRNA的靶基因。 結(jié)論： 通過檢測分析 MicroRNA-1 和 ET-1 mRNA在小鼠和人部分組織細胞以及C2C12小鼠成肌細胞分化過程中空間表

15、達分布和時序表達變化，發(fā)現(xiàn)二者在表達分布和變化趨勢上存在負相關性，提示MicroRNA-1可能參與 ET-1基因表達調(diào)控；通過生物信息檢索，我們在人ET-13’LITR上找到3個MicroRNA-1潛在作用靶序列；利用螢光報告基因系統(tǒng)我們發(fā)現(xiàn)MicroRNA-1能夠抑制融合人 ET-13’UTR的螢光素酶報告基因的表達，表明MicroRNA-1對 ET-13’UTR存在抑制性功能作用；結(jié)合生物信息學預測的結(jié)果，我們利用MicroRNA-

16、1靶序列缺失和突變的方法，證明了MicroRNA-1對重組螢光素酶報告基因的抑制效應由人 ET-1 3’UTR上第127-151位核苷酸處的MicroRNA-1靶序列所介導。最后，在Hela細胞中進一步證實了MicroRNA-1能夠在轉(zhuǎn)錄后水平抑制內(nèi)源性ET-1基因的表達。我們的研究初步確認MicroRNA-1對ET-1基因表達的抑制作用，證明了這種調(diào)控效應發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，明確了介導這一效應的MicroRNA-1靶序列，從而進一步拓展