C端不同長度的乙肝病毒核心顆粒的結構分析與比較.pdf

1、乙肝病毒(Hepatitis B virus，HBV)屬嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)，正嗜肝DNA病毒屬(Hepadnavirus)，是一種對人類健康危害極大的肝炎病毒。
　　 雖然目前已有乙肝預防疫苗，但是疫苗對人體差異性的應對率較低，而且至今缺乏有效的乙肝治療藥物，本文嘗試從乙肝核心抗原(Hepatitis B core antigen,HBcAg)顆粒的三維結構出發(fā)，探討乙肝病毒的核酸包裹機制，為防治乙

2、肝疾病提供新的依據。
　　 目前冷凍電鏡三維重構技術(Cryo-electron microscopy3D reconstructiontechnique)已成為病毒結構與功能研究的重要手段，本文采用該技術對3'端具有不同長度的HBcAg基因所表達出的HBcAg顆粒結構(C端氨基酸長度不同)進行了重構、分析和比較，得到如下結果：
　　 1.通過將各組HBcAg顆粒的冷凍電鏡三維結構與HBcAg蛋白(residue1-14

3、9)的X射線晶體結構進行擬合比較后可以發(fā)現(xiàn)：各組HBcAg顆粒的衣殼結構都基本一致，主要不同在于衣殼內部的核酸容量。這是因為蛋白框架的剛性結構主要由HBcAg蛋白的N端氨基酸，residue1-140區(qū)段提供，該區(qū)段是組裝出HBcAg顆粒的必要氨基酸數(shù)，雖然各組HBcAg顆粒在residue140之后的氨基酸長度不同，但并不影響它們衣殼結構的相似性。
　　 2.HBcAg蛋白的C端氨基酸，residue149-183由于富含精氨

4、酸，主要用于結合核酸--RNA，而且RNA的結合量跟C端氨基酸的長度即精氨酸的數(shù)量成正比，因為精氨酸越多，則能提供更多的正電荷和核酸結合。另外由于表達的HBcAg顆粒缺乏病毒的RDDP,DDDP,RNase H等核酸復制相關酶，以致衣殼內部的核酸只能停留在RNA階段，無法轉錄成dsDNA，即HBV的最終基因組核酸形式。
　　 3.在N端和C端中間的這一段，residue141-148，盡管缺乏結構信息，但從我們三維結構的核酸分布

5、位置(靠近衣殼的內壁，顆粒突起的下方)來看，可能主要起連接作用，即把核酸結合區(qū)牽引于HBcAg顆粒的衣殼內壁附近。
　　 4.HBcAg蛋白residue142/143之后的氨基酸片斷柔性很高，現(xiàn)有的結構解析方法都無法獲得穩(wěn)定的信號，以致其后的氨基酸片斷都缺失了，無論是X射線晶體衍射，還是我們的冷凍電鏡三維重構結果都印證了這一點。但從HBcAg-164minus、HBcAg-167minus和HBcAg-183minus三組顆粒

6、的核酸分布位置來推測，C端氨基酸應該纏繞分布于衣殼的內部附近，而不是完全散亂、平均分布于整個顆粒內部，這應該和HBcAg蛋白C端氨基酸向內伸入的位置有關。而且當顯示閾值被調低后，可觀察到HBcAg蛋白基部新出現(xiàn)的電子密度開始與核酸區(qū)域連接，將HBcAg蛋白(residue1-149)的晶體結構擬合進冷凍電鏡電子密度中，發(fā)現(xiàn)亞基B和C的loop結構開始插入新出現(xiàn)的電子密度中，方向直指黃色的核酸區(qū)。
　　 5.添加核酸酶后，HBcA