豬囊性纖維化跨膜電導(dǎo)調(diào)節(jié)因子及其ΔF508突變體的細(xì)胞生物學(xué)和分子藥理學(xué)研究.pdf

1、CFTR(cysticfibrosistransmembraneconductanceregulator，CFTR)即囊性纖維化跨膜電導(dǎo)調(diào)節(jié)因子，是一種cAMP依賴的Cl-通道，廣泛表達(dá)于呼吸道、胰腺、胃腸道、睪丸、汗腺和唾液腺等多種分泌型和吸收型上皮，主要參與電解質(zhì)、液體轉(zhuǎn)運(yùn)以及調(diào)節(jié)其它膜通道蛋白的功能。其基因突變導(dǎo)致白種人中常見的致死性常染色體隱性遺傳疾病即囊性纖維化病(cysticfibrosis，CF)。其中最為常見的突變類型是

2、△F508(第508位氨基酸苯丙氨酸缺失)，有90％的CF病人其一條染色體都攜有△F508突變。CF疾病的主要特征是反復(fù)的肺部感染、結(jié)構(gòu)破壞和纖維修復(fù)，最終導(dǎo)致肺功能不可逆性的喪失，這也是CF疾病高發(fā)病率和致死性的主要原因。由于缺少合適的動物模型，CF發(fā)病機(jī)理并不清楚。盡管在CFTR基因克隆后，建立了許多CF小鼠轉(zhuǎn)基因模型，并且這些小鼠也重現(xiàn)了CF病人的腸道病變。但由于小鼠與人在氣道細(xì)胞生物學(xué)、粘膜下腺表達(dá)量以及小鼠氣道可能存在其它的非

3、CFTR介導(dǎo)的氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)，CF轉(zhuǎn)基因小鼠模型未能表現(xiàn)作為CF病人主要致死原因的肺部病變。因此，需要尋找其它的動物建立CF模型。 豬在解剖學(xué)、生理學(xué)上和人有極大的相似性，比較適合建立CF動物模型。此外，由于豬具有較長的壽命，使得對于CF肺疾病的發(fā)生、治療手段的長期治療效果以及副作用的研究成為可能?，F(xiàn)在很多研究者致力于構(gòu)建豬CFTR基因敲除豬和△F508突變豬CF模型。但由于基因敲除豬也可能發(fā)生類似于基因敲除鼠的腸梗阻，在未發(fā)生肺部

4、疾病前過早死亡，使后續(xù)研究難以進(jìn)行。此外，我們實(shí)驗(yàn)室和美國Ostedgaad等的近期研究發(fā)現(xiàn)，豬△F508-CFTR在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型中能夠正常加工成熟轉(zhuǎn)運(yùn)到質(zhì)膜，提示豬△F508轉(zhuǎn)基因模型將不會出現(xiàn)預(yù)期的表型。用CFTR特異性抑制劑誘導(dǎo)豬CF模型是另一個(gè)可行的策略。但現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)的人CFTR特異性抑制劑CFTRinh-172對豬CFTR的親和力差，抑制效果并不明顯，并且本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，該藥不能誘導(dǎo)豬CF模型的產(chǎn)生。另一種CFTR抑制

5、劑GlyH-101雖然對豬有較好的抑制效果，但其在動物體內(nèi)分布和代謝情況并不清楚，是否適合用來做藥物誘導(dǎo)豬CF模型也不清楚。因此，需要尋找高親和力、高特異性、在豬體內(nèi)主要CF病變器官分布較高的豬CFTR抑制劑來誘導(dǎo)豬CF模型。 本文的目的是系統(tǒng)研究豬△F508-CFTR的細(xì)胞生物學(xué)和電生理特征，并通過高通量篩選發(fā)現(xiàn)新的豬CFTR特異性、高親和力抑制劑，為建立豬CF藥理模型奠定基礎(chǔ)。首先利用PCR方法我們獲得了豬CFTR基因，并將

6、其連入真核表達(dá)載體pcDNA3.1Zeo。對豬CFTR基因進(jìn)行點(diǎn)突變，獲得了豬△F508-CFTR，也將其連入真核表達(dá)載體pcDNA3.1Zeo。將這兩個(gè)構(gòu)建好的重組質(zhì)粒與對碘離子敏感的綠色熒光蛋白突變體EYFP-H148Q-I152L穩(wěn)定轉(zhuǎn)染FRT(fisher大鼠甲狀腺上皮細(xì)胞)，建立了豬CFTR高通量篩選細(xì)胞模型。利用自己制備的針對豬CFTRNBD2結(jié)構(gòu)域的多克隆抗體，對瞬時(shí)及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染野生型和△F508-pCFTR的Cos7細(xì)胞及

7、FRT細(xì)胞進(jìn)行免疫印記及免疫熒光分析，發(fā)現(xiàn)△F508-pCFTR蛋白大部分(77.8％)都具有成熟型糖基化形式，能夠被正常轉(zhuǎn)運(yùn)上膜。通過Cl-電流熒光測定、短路電流分析以及全細(xì)胞膜片鉗電流測定，發(fā)現(xiàn)△F508-pCFTR具有依賴于cAMP激活的Cl-轉(zhuǎn)運(yùn)功能。較野生型相比，△F508-pCFTR對cAMP激動劑forskolin的敏感性降低10倍(EC505μMvsEC500.5μM)；其forskolin激活的最大電流為野生型的61％

8、；對人CFTR抑制劑CFTRinh-172和GlyH-101的靈敏性更高，1μMCFTRinh-172對△F508-pCFTR和野生型CFTR的抑制百分率分別為40％和20％。這些結(jié)果都表明豬△F508突變是一種“溫和性”突變，突變蛋白能正常轉(zhuǎn)運(yùn)到達(dá)頂質(zhì)膜，只是功能較野生型有所降低。以往的研究表明，10％的人△F508-CFTR轉(zhuǎn)運(yùn)到達(dá)頂質(zhì)膜就可以避免CF癥狀的發(fā)生，因此△F508轉(zhuǎn)基因豬CF模型不會出現(xiàn)預(yù)期表型。 此外，對Gl

9、yH-10l在小鼠體內(nèi)的分布、代謝情況進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)其在小鼠肺內(nèi)分布并不明顯，并很快被清除干凈。據(jù)此我們推斷其在豬體內(nèi)也具有類似分布代謝情況，提示GlyH-101并不適合作為藥物來誘導(dǎo)豬CF模型。因此，需要尋找對豬更有效的特異性抑制劑。 利用構(gòu)建的FRT/EYFP-H148Q-1152L/pCFTR穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型，通過高通量篩選技術(shù)對含10萬個(gè)結(jié)構(gòu)多樣的小分子組合化學(xué)庫進(jìn)行抑制劑的篩選，發(fā)現(xiàn)了3個(gè)新的豬CFTR特異性抑制

10、劑。其中活性最好的PI1，能夠以劑量依賴的方式抑制FRT單層上皮細(xì)胞CPT-cAMP激活的豬CFTR短路電流，其IC50為13.34μM，且這種作用具有快速、可逆、無毒的特點(diǎn)。在小鼠體內(nèi)活性試驗(yàn)中，可有效抑制霍亂毒素誘導(dǎo)的腸道液體分泌(80％)。 通過以上研究，進(jìn)一步證實(shí)豬△F508突變CFTR的細(xì)胞生物學(xué)行為與人△F508-pCFTR有顯著差異，提示豬△F508轉(zhuǎn)基因模型將不會出現(xiàn)預(yù)期的表型。此外，我們對10萬個(gè)小分子組合化學(xué)