縫隙連接細胞間通訊在“自組裝”工程化軟骨構建過程中的作用研究.pdf

1、目的：探討縫隙連接細胞間通訊在以生長分化因子5(GDF-5)誘導的人骨髓間充質干細胞(hMSCs)“自組裝”形成軟骨組織過程中的作用。
　　方法：體外培養(yǎng)hMSCs,貼壁細胞傳代,取第三代細胞,按兩種培養(yǎng)方式培養(yǎng)。一、單層培養(yǎng)。分為三組,每組各用軟骨誘導液、含100ng/mlGDF-5、2.5μM1-庚醇(1-heptanol)的軟骨誘導液以及含100ng/mlGDF-5的軟骨誘導液誘導培養(yǎng)三周。三周后對各組細胞進行共聚焦激光漂白

2、恢復測定各組細胞的熒光恢復率;免疫熒光染色檢測各組細胞Ⅱ型膠原和蛋白多糖表達情況。二、“自組裝”培養(yǎng)。將第三代細胞按一定密度接種于2％瓊脂糖包被的24孔板,進行自組裝培養(yǎng),形成組織團塊,培養(yǎng)3周。根據軟骨誘導液中刺激因子的不同分為三組:A組僅用軟骨誘導液(CM)誘導培養(yǎng);B組用含100ng/mlGDF-5、2.5μM1-heptanol的軟骨誘導液誘導培養(yǎng)(CM+100ng/mlGDF-5+2.5μM1-heptanol);C組用含10

3、0ng/mlGDF-5的軟骨誘導液誘導培養(yǎng)(CM+100ng/mlGDF-5)。對三組的自組裝組織團塊進行大體觀察;生物化學分別檢測1,2,3周三組團塊GAG的含量變化;Real-timePCR檢測組織團塊縫隙連接蛋白43(Cx43)、Ⅱ型膠原和蛋白多糖mRNA的表達;HE染色觀察自組裝組織細胞結構;免疫熒光、番紅O、甲苯胺藍染色檢測誘導細胞Cx43、Ⅱ型膠原和蛋白多糖表達。對免疫熒光圖像每個視野下陽性反應物的平均光密度進行測定,并對三

4、組進行比較。
　　結果：GDF-5處理組的單層細胞熒光恢復率為(42.45%±2.52%),1-heptanol處理組的單層細胞熒光恢復率為(22.75±1.86%),空白對照組的單層細胞熒光恢復率為(20.18±2.03%),有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。免疫熒光顯示GDF-5處理組細胞表達的Ⅱ型膠原和蛋白多糖最為強烈,1-heptanol處理組合空白對照組Ⅱ型膠原和蛋白多糖表達較弱。通過對hMSCs的自組裝培養(yǎng),形成了類似軟骨

5、的組織團塊。A組團塊的GAG含量在t=1w為(2.13±0.40),在t=3w為(2.65±0.52);B組團塊的GAG含量在t=1w為(3.10±0.30),在t=3w為(3.94±0.45);C組團塊的GAG含量在t=1w為(3.536±0.34),在t=3w為(5.918±0.46),增加最為顯著。Cx43、Ⅱ型膠原和蛋白多糖mRNA表達明顯,免疫熒光顯示Ⅱ型膠原蛋白、蛋白多糖表達陽性,番紅O染色顯示蛋白多糖表達陽性。C組自組裝組

6、織塊Ⅱ型膠原、蛋白多糖mRNA表達明顯大于其他兩組,Cx43表達強于A組團塊,略高于B組,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。A組Ⅱ型膠原免疫熒光平均光密度為(0.3678±0.0321),B組平均光密度為(0.4808±0.0415),C組平均光密度為(0.7112±0.0212),有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。A組aggrecan免疫熒光平均光密度為(0.3778±0.0350),B組平均光密度為(0.4828±0.0401),C組

7、平均光密度為(0.6722±0.0362),有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。A組Cx43免疫熒光平均光密度為(0.4265±0.0524),B組平均光密度為(0.6358±0.0585),C組平均光密度為(0.6872±0.0382),A組與其他兩組相比有統(tǒng)計學差異(P<0.05),B、C組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　結論：應用“自組裝”技術聯(lián)合GDF-5能有效構建工程化軟骨,Cx43蛋白介導的縫隙連接細胞間通訊在“