縫隙連接介導的細胞間通訊及其與逼尿肌不穩(wěn)定關系的實驗研究.pdf

1、背景及目的:逼尿肌不穩(wěn)定(detrusor instability,簡稱DI)指儲尿期出現(xiàn)逼尿肌無抑制性收縮,是多種病變(如神經(jīng)疾病、膀胱出口梗阻等)的一個病理生理環(huán)節(jié),是最常見的一種膀胱功能障礙.迄今為止,對DI的確切發(fā)病原因仍不清楚,且臨床治療效果不盡人意.因此,臨床上迫切需要尋找一種行之有效的治療DI新方法.由于正常逼尿肌收縮主要是由神經(jīng)參與的一種協(xié)調性活動,因此逼尿肌細胞間的興奮傳遞作用并不起主導作用.而在DI發(fā)生過程中,由于逼

2、尿肌本身是一種具有自發(fā)性興奮能力的組織,對于單個的逼尿肌細胞而言,當其興奮后通過興奮收縮耦聯(lián)要引起整個膀胱組織協(xié)調一致收縮,必須經(jīng)過特殊的細胞間傳遞機制才能完成.因此,細胞間的興奮傳遞可能在DI發(fā)生中有極其重要的作用.細胞間興奮傳遞在心肌、子宮等組織的正常和異常功能活動中的作用已為人們所熟悉:存在于心肌細胞之間的閏盤結構使起搏點的興奮沖動能迅速擴布于整個心臟;在子宮平滑肌中縫隙連接(gap junctions, GJ)的形成是足月分娩和

3、早產(chǎn)發(fā)動的結構基礎,而抑制GJ的增加可成功地治療和預防早產(chǎn)等.目前,對膀胱逼尿肌的興奮傳導所知甚少,國內外尚未見細胞間興奮傳遞與DI關系的深入研究報道.因此,研究逼尿肌細胞間興奮傳遞,將有助于我們了解DI的發(fā)生機理,并為開發(fā)新型DI治療藥物提供理論依據(jù).本課題通過改良的不全結扎大鼠膀胱頸部和/或近端尿道的方法,建立了更加穩(wěn)定、合理的大鼠膀胱出口梗阻(bladder outlet obstruction,BOO)引起的DI動物實驗模型,并

4、從以下幾個層次逐步深入地對膀胱逼尿肌組織及細胞進行研究.第一,在了解BOO后逼尿肌功能變化的基礎上,進一步觀察逼尿肌細胞間的超微結構變化,以揭示其功能變化的組織形態(tài)學基礎.第二,在組織水平上從轉錄及翻譯水平研究縫隙連接基因(connexin,Cx)及其蛋白表達與DI的關系及其生物學意義,探討細胞間縫隙連接基因蛋白與DI發(fā)生的關系.第三,首次利用激光掃描共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscope,

5、LSCM)結合熒光光漂白恢復技術(fluorescence redistribution after photobleaching,FRAP),來動態(tài)研究觀測逼尿肌縫隙連接介導的細胞間通訊(gap junction intercellular communication,GJIC)的功能變化,對DI的發(fā)病機理做進一步探討,為臨床治療提供理論性指導.第四,利用LSCM及FRAP技術觀察縫隙連接阻滯劑18β-GA對培養(yǎng)的大鼠DI逼尿肌細胞G

6、JIC功能的影響,為臨床上采用阻斷細胞間興奮傳遞來治療DI開辟新的方法及提供理論依據(jù).方法:本實驗通過改良的不全結扎大鼠膀胱頸部和/或近端尿道的方法,建立了更加穩(wěn)定、合理的大鼠BOO后引起DI的動物實驗模型.根據(jù)尿動力學檢查結果采用隨機法將動物分為:逼尿肌穩(wěn)定組即正常對照組(control group),逼尿肌不穩(wěn)定組(Detrusor Instability Group).光鏡和透射電鏡下觀察逼尿肌組織及其細胞間連接的超微結構改變;應

7、用RT-PCR技術及Western-blot方法,從轉錄及翻譯水平檢測細胞間縫隙連接蛋白基因(Cx)及其蛋白在DI中的表達變化;免疫組織化學方法鑒定培養(yǎng)逼尿肌細胞;采用間接免疫熒光染色法,對培養(yǎng)逼尿肌細胞Cx43表達進行定位分析;利用LSCM及FRAP技術,來研究觀測逼尿肌GJIC的功能變化;觀察縫隙連接阻滯劑18β-GA對培養(yǎng)的大鼠DI逼尿肌細胞GJIC功能的影響變化.結果:主要研究結果如下:1.采用改良法建立的動物模型較之以往采用的

8、方法能夠更為確切地模擬臨床上最為常見的BOO類型的疾病.其DI的發(fā)生率高達80.6﹪.2.光鏡觀察:對照組逼尿肌細胞之間平行排列,細胞呈梭形或橢圓形,分布均勻.DI組細胞增大,形狀多樣,排列紊亂.電鏡觀察:對照組逼尿肌細胞間連接以中間連接為主,細胞內膜面有附著于胞質內的微絲.DI組逼尿肌細胞間連接以縫隙連接為主,肌膜周圍有高電子密度物質堆積.3.Cx43、Cx40、Cx45mRNA在DI組及正常對照組膀胱逼尿肌中均有表達.DI組中Cx4

9、3、Cx40mRNA表達較正常對照組明顯增加,分別增加5.4和2.9倍,各組兩者相比較具有顯著性差異;而Cx45mRNA表達無顯著性差異.4.DI組逼尿肌組織有高水平的Cx43蛋白表達,與對照組相比較增加3.2倍,兩者相比較具有顯著性差異,與其Cx43mRNA表達程度相近似.5.間接免疫熒光染色方法發(fā)現(xiàn),DI組逼尿肌細胞Cx43的表達,呈現(xiàn)較強的FITC綠色熒光,大量強陽性反應產(chǎn)物主要分布于細胞膜上.正常對照組Cx43的表達,FITC熒

10、光產(chǎn)物強度明顯減弱.6.FRAP方法研究膀胱逼尿肌細胞GJIC功能變化,結果顯示:熒光標記染色膀胱逼尿肌細胞呈單層貼壁生長.在DI組中,經(jīng)瞬間漂白后細胞內熒光強度明顯變弱,隨著時間的推移,熒光逐漸恢復,至第4min時,可見熒光強度明顯恢復,平均熒光恢復率為(35.791±0.836)﹪,而單個細胞未見熒光強度恢復現(xiàn)象.正常對照組在相同的時間內,漂白細胞熒光恢復不明顯,平均熒光恢復率為(8.645±0.673)﹪.在漂白后的第4min時,

11、兩組平均熒光恢復率相比較,DI組顯著高于對照組,兩者具有顯著性差異.表明DI逼尿肌細胞間興奮傳遞增強.7.不同濃度的18β-GA(10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L和160μmol/L)作用于DI組培養(yǎng)逼尿肌細胞2小時后,明顯降低逼尿肌細胞的熒光恢復率,其熒光恢復率分別為20.254﹪、12.812﹪、7.094﹪、6.235﹪和3.182﹪,且呈濃度依賴關系.8.同一濃度18β-GA(40μmol/

12、L)作用于DI組培養(yǎng)逼尿肌細胞,處理不同時間(1h、2h、3h和4h)后,其熒光恢復率分別為8.152﹪、7.289﹪、7.094﹪和6.694﹪,且與作用時間無明顯依賴關系.9.移除18β-GA處理后不同時間DI組培養(yǎng)逼尿肌細胞GJIC功能變化.10μmol/L18β-GA的低濃度組,熒光恢復較快,在18β-GA作用(2h)被移除后不同時間0分鐘、30分鐘、60分鐘和90分鐘內,其熒光恢復率分別為:16.236﹪、22.186﹪、35

13、.465﹪和37.824﹪;而160μmol/L18β-GA的高濃度組,熒光恢復較慢,在18β-GA作用(2h)被移除后不同時間0分鐘、30分鐘、60分鐘和90分鐘內,其熒光恢復率分別為:4.386﹪、8.267﹪、16.489﹪和20.526﹪.說明18β-GA藥物作用具有可恢復性和安全性.結論:1.縫隙連接是逼尿肌細胞間興奮傳遞的重要結構基礎;2. 本研究首次采用FRAP技術從功能上證明DI逼尿肌GJIC增強;3. DI逼尿肌細胞間