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文檔簡介
1、細(xì)胞縫隙連接通訊(Gap junctional intercellular communication,GJIC)是哺乳動物細(xì)胞間普遍存在的一種通訊方式,在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、死亡等生理過程中具有重要作用。鎘是一種重要的工業(yè)和環(huán)境污染物,危害人和動物的健康,肝臟是鎘的重要靶器官之一。鎘不僅引起肝細(xì)胞凋亡,還能抑制肝細(xì)胞GJIC,影響細(xì)胞縫隙連接蛋白的表達(dá)和分布,但GJIC在鎘暴露肝臟損傷過程中的作用機(jī)制尚不明確。本研究在體外用2.5、
2、10μmol/L鎘和50μmol/L紅景天苷(Salidroside,Sal)單獨(dú)或聯(lián)合作用BRL3A細(xì)胞6、12h;并選擇80-100g雌性SD大鼠,50mg/L鎘自由飲水,35mg/kg B.W.Sal每天灌胃一次,單獨(dú)或聯(lián)合處理12周,建立動物模型。通過細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)方法,探討鎘致大鼠肝臟損傷過程中GJIC的變化以及其在鈣離子通路、MAPK通路以及自噬調(diào)控鎘致肝細(xì)胞毒性損傷中的作用機(jī)制,并闡明Sal在上述過程中的保護(hù)作用。
3、為揭示鎘致肝臟毒性損傷的分子機(jī)制提供依據(jù)。
1、鎘致大鼠肝細(xì)胞損傷及Sal的保護(hù)作用
為了研究鎘對大鼠肝細(xì)胞毒性的影響,本試驗通過體內(nèi)、體外試驗檢測鎘及Sal對SD大鼠細(xì)胞活力、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞指數(shù)、肝臟臟器指數(shù)、肝臟組織病理學(xué)變化和肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。體外試驗結(jié)果表明,不同劑量鎘(2.5、5、10、20μmol/L)暴露致BRL3A細(xì)胞皺縮、細(xì)胞間隙增大、死細(xì)胞增多、細(xì)胞核收縮、變形、破裂,核染色質(zhì)濃縮成點狀分布、
4、細(xì)胞存活率下降、細(xì)胞指數(shù)(CI)下降,并且呈明顯的時間-劑量效應(yīng)。不同濃度(25、50、100μmol/L)Sal對CI無顯著影響,提示Sal在所選濃度范圍內(nèi)基本無細(xì)胞毒性。染鎘組與50μmol/L Sal聯(lián)合處理明顯減輕鎘導(dǎo)致的CI下降速度。這一結(jié)果表明,50μmol/L Sal對2.5μmol/L Cd和10μmol/L Cd導(dǎo)致的細(xì)胞毒性有保護(hù)作用。體內(nèi)試驗結(jié)果表明,染鎘組(50 mg/kg B.W.)大鼠肝臟脂肪變性,肝細(xì)胞排列
5、紊亂,中央靜脈淤血。 Cd與Sal聯(lián)合處理組大鼠肝臟脂肪變性相對于染鎘組有明顯好轉(zhuǎn)。透射電鏡觀察肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),染鎘組的肝細(xì)胞核染色質(zhì)明顯收縮,細(xì)胞核固縮、濃染;線粒體腫脹,線粒體嵴模糊、斷裂甚至崩解,部分形成空泡。Sal可明顯減輕Cd對大鼠肝細(xì)胞線粒體和細(xì)胞核的損傷。
2、鎘對大鼠GJIC的影響
為了研究鎘對GJIC的影響,通過染料劃痕示蹤法檢測GJIC,免疫印跡法檢測連接蛋白Cx43、Cx32,實時定量PCR
6、檢測Cx43、Cx32相關(guān)基因表達(dá),RTCA檢測細(xì)胞指數(shù),免疫熒光觀察Cx43在BRL3A細(xì)胞上的分布,免疫電鏡觀察連接蛋白在肝細(xì)胞上的分布,Transwell共培養(yǎng)體系觀察鎘暴露受損肝細(xì)胞通過GJIC對正常肝細(xì)胞的影響。結(jié)果表明,Cd能下調(diào)BRL3A細(xì)胞中Cx43、Cx32的表達(dá)水平以及Cx43磷酸化水平(p<0.05或p<0.01),動物試驗也證實Cd可下調(diào)Cx32的表達(dá)。GJIC抑制劑GA與Cd聯(lián)合處理加劇了Cd致CI的下降,提示
7、GA加劇了Cd的細(xì)胞毒性。鎘暴露細(xì)胞可導(dǎo)致與之相鄰的正常細(xì)胞損傷,添加Sal以及GJIC抑制劑GA可明顯減輕鎘暴露受損細(xì)胞對正常細(xì)胞的毒性損傷作用。Sal可抑制Cd對GJIC的相關(guān)影響。提示Cd引起的GJIC抑制具有雙重作用,保護(hù)正常細(xì)胞免受Cd暴露細(xì)胞的毒性損傷作用以及進(jìn)一步加強(qiáng)Cd對鎘暴露受損細(xì)胞的毒性作用。
3、GJIC參與調(diào)節(jié)鈣離子通路介導(dǎo)的鎘致大鼠肝臟毒性損傷
為了探討鈣離子通路在鎘致大鼠肝細(xì)胞損傷中的作用
8、以及紅景天苷的保護(hù)機(jī)制,本試驗通過體外添加鈣離子通路相關(guān)抑制劑,用流式細(xì)胞術(shù)檢測BRL3A細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度、免疫印跡法檢測BRL3A細(xì)胞鈣離子通路相關(guān)蛋白、實時定量PCR檢測鈣離子通路相關(guān)基因表達(dá)、RTCA檢測細(xì)胞指數(shù)。結(jié)果表明,鎘能引起B(yǎng)RL3A細(xì)胞[Ca2+]i升高(p<0.01),通過添加細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子螯合劑BAPTA-AM可抑制鎘導(dǎo)致的細(xì)胞指數(shù)和細(xì)胞存活率的下降,添加Sal也有類似的作用。用EGTA螯合細(xì)胞外鈣離子可抑制鎘介導(dǎo)
9、的胞存活率的下降,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵抑制劑TG可促進(jìn)鎘介導(dǎo)的細(xì)胞存活率的下降(p<0.01或p<0.05)。體內(nèi)和體外試驗都表明鎘能下調(diào)CaM mRNA的表達(dá),說明CaM參與了重金屬鎘對肝細(xì)胞的毒性損傷過程。GJIC抑制劑GA單獨(dú)處理可引起細(xì)胞[Ca2+]i升高,GA還進(jìn)一步促進(jìn)鎘致BRL3A細(xì)胞鈣超載,細(xì)胞外鈣離子螯合劑EGTA可部分抑制鎘誘導(dǎo)的BRL3A細(xì)胞[Ca2+]i升高,但EGTA與GA聯(lián)合則惡化鎘誘導(dǎo)的BRL3A細(xì)胞[Ca2+]i升
10、高,TG單獨(dú)處理就能引起[Ca2+]i的升高以及細(xì)胞成活率下降,與鎘聯(lián)合則進(jìn)一步加劇對細(xì)胞的損傷作用(p<0.01)。表明GJIC與鈣離子通路關(guān)系密切,誘導(dǎo)細(xì)胞[Ca2+]i升高是鎘發(fā)揮細(xì)胞毒性的重要途徑,鎘引起的肝細(xì)胞鈣超載主要是由于鎘誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣庫(尤其是內(nèi)質(zhì)網(wǎng))的釋放導(dǎo)致的,Sal可作為保護(hù)劑通過GJIC與鈣離子通路發(fā)揮對鎘致肝細(xì)胞毒性損傷的保護(hù)作用。
4、GJIC參與調(diào)節(jié)MAPK通路介導(dǎo)的鎘致大鼠肝臟毒性損傷
11、 為了探討鎘致大鼠肝細(xì)胞損傷中MAPK通路與GJIC的交互作用以及紅景天苷的保護(hù)機(jī)制,本試驗通過體外添加MAPK通路相關(guān)抑制劑,如ERK制劑U0126、JNK制劑SP600125、p38抑制劑SB202190,同時結(jié)合保護(hù)劑Sal、GJIC抑制劑GA,用染料劃痕示蹤法檢測GJIC,免疫印跡法檢測BRL3A細(xì)胞MAPK通路相關(guān)蛋白表達(dá),實時定量PCR檢測Cx32基因表達(dá);RTCA檢測細(xì)胞指數(shù),Transwell共培養(yǎng)體系觀察MAPK通路在
12、鎘暴露受損肝細(xì)胞通過GJIC對正常肝細(xì)胞損傷的影響。結(jié)果表明,鎘致BRL3A細(xì)胞以及大鼠肝細(xì)胞發(fā)生毒性損傷過程中MAPK關(guān)鍵信號分子ERK、JNK、p38MAPK發(fā)生磷酸化,通過添加Sal可以明顯抑制ERK、JNK、p38MAPK蛋白的活化進(jìn)而減輕鎘的細(xì)胞毒性損傷作用。添加相關(guān)抑制劑發(fā)現(xiàn),抑制ERK以及p38MAPK蛋白磷酸化可明顯抑制鎘誘導(dǎo)的BRL3A細(xì)胞指數(shù)的下降,抑制JNK磷酸化則對細(xì)胞指數(shù)的影響較小。抑制MAPKs的活化可上調(diào)C
13、x32mRNA的表達(dá)和Cx43蛋白的表達(dá),改善鎘誘導(dǎo)的GJIC的抑制作用,同時對鎘損傷細(xì)胞通過GJIC對正常細(xì)胞的毒性損傷作用具有明顯的保護(hù)作用。而抑制GJIC對鎘誘導(dǎo)BRL3A細(xì)胞MAPK通路的激活幾乎無影響。
5、細(xì)胞縫隙連接通訊在鎘誘導(dǎo)大鼠肝細(xì)胞自噬中的作用為了探討鎘引起的自噬與GJIC的關(guān)系,本研究通過體外添加自噬特異性抑制劑羥氯喹(CQ)以及自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素(RAP),同時結(jié)合GJIC抑制劑甘珀酸(CBX),用單丹
14、磺酰尸胺(MDC)染色法觀察晚期自噬溶酶體,免疫印跡法檢測自噬蛋白LC3、連接蛋白Cx43的表達(dá),實時定量PCR檢測自噬相關(guān)基因Atg-5、Atg-7、Beclin-1表達(dá),探討鎘暴露大鼠肝細(xì)胞過程中自噬與GJIC的變化。結(jié)果表明,MDC染色證實了鎘誘導(dǎo)BRL3A細(xì)胞發(fā)生自噬,同時自噬相關(guān)基因Beclin-1、Atg5、Atg7表達(dá)上調(diào)(p<0.01),LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)增多,并具有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系(p<0.01)。抑制自噬可進(jìn)一步
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