細胞縫隙連接通訊在鎘致大鼠肝細胞損傷中的作用及調控機制.pdf

1、細胞縫隙連接通訊（Gap junctional intercellular communication，GJIC）是哺乳動物細胞間普遍存在的一種通訊方式，在細胞增殖、分化、凋亡、死亡等生理過程中具有重要作用。鎘是一種重要的工業(yè)和環(huán)境污染物，危害人和動物的健康，肝臟是鎘的重要靶器官之一。鎘不僅引起肝細胞凋亡，還能抑制肝細胞GJIC，影響細胞縫隙連接蛋白的表達和分布，但GJIC在鎘暴露肝臟損傷過程中的作用機制尚不明確。本研究在體外用2.5、

2、10μmol/L鎘和50μmol/L紅景天苷(Salidroside，Sal)單獨或聯(lián)合作用BRL3A細胞6、12h;并選擇80-100g雌性SD大鼠，50mg/L鎘自由飲水，35mg/kg B.W.Sal每天灌胃一次，單獨或聯(lián)合處理12周，建立動物模型。通過細胞生物學和分子生物學方法，探討鎘致大鼠肝臟損傷過程中GJIC的變化以及其在鈣離子通路、MAPK通路以及自噬調控鎘致肝細胞毒性損傷中的作用機制，并闡明Sal在上述過程中的保護作用。

3、為揭示鎘致肝臟毒性損傷的分子機制提供依據(jù)。
　　1、鎘致大鼠肝細胞損傷及Sal的保護作用
　　為了研究鎘對大鼠肝細胞毒性的影響，本試驗通過體內、體外試驗檢測鎘及Sal對SD大鼠細胞活力、細胞形態(tài)、細胞指數(shù)、肝臟臟器指數(shù)、肝臟組織病理學變化和肝細胞超微結構的變化。體外試驗結果表明，不同劑量鎘（2.5、5、10、20μmol/L）暴露致BRL3A細胞皺縮、細胞間隙增大、死細胞增多、細胞核收縮、變形、破裂，核染色質濃縮成點狀分布、

4、細胞存活率下降、細胞指數(shù)(CI)下降，并且呈明顯的時間-劑量效應。不同濃度(25、50、100μmol/L)Sal對CI無顯著影響，提示Sal在所選濃度范圍內基本無細胞毒性。染鎘組與50μmol/L Sal聯(lián)合處理明顯減輕鎘導致的CI下降速度。這一結果表明，50μmol/L Sal對2.5μmol/L Cd和10μmol/L Cd導致的細胞毒性有保護作用。體內試驗結果表明，染鎘組（50 mg/kg B.W.）大鼠肝臟脂肪變性，肝細胞排列

5、紊亂，中央靜脈淤血。 Cd與Sal聯(lián)合處理組大鼠肝臟脂肪變性相對于染鎘組有明顯好轉。透射電鏡觀察肝細胞超微結構發(fā)現(xiàn)，染鎘組的肝細胞核染色質明顯收縮，細胞核固縮、濃染;線粒體腫脹，線粒體嵴模糊、斷裂甚至崩解，部分形成空泡。Sal可明顯減輕Cd對大鼠肝細胞線粒體和細胞核的損傷。
　　2、鎘對大鼠GJIC的影響
　　為了研究鎘對GJIC的影響，通過染料劃痕示蹤法檢測GJIC，免疫印跡法檢測連接蛋白Cx43、Cx32，實時定量PCR

6、檢測Cx43、Cx32相關基因表達，RTCA檢測細胞指數(shù)，免疫熒光觀察Cx43在BRL3A細胞上的分布，免疫電鏡觀察連接蛋白在肝細胞上的分布，Transwell共培養(yǎng)體系觀察鎘暴露受損肝細胞通過GJIC對正常肝細胞的影響。結果表明，Cd能下調BRL3A細胞中Cx43、Cx32的表達水平以及Cx43磷酸化水平(p＜0.05或p＜0.01），動物試驗也證實Cd可下調Cx32的表達。GJIC抑制劑GA與Cd聯(lián)合處理加劇了Cd致CI的下降，提示

7、GA加劇了Cd的細胞毒性。鎘暴露細胞可導致與之相鄰的正常細胞損傷，添加Sal以及GJIC抑制劑GA可明顯減輕鎘暴露受損細胞對正常細胞的毒性損傷作用。Sal可抑制Cd對GJIC的相關影響。提示Cd引起的GJIC抑制具有雙重作用，保護正常細胞免受Cd暴露細胞的毒性損傷作用以及進一步加強Cd對鎘暴露受損細胞的毒性作用。
　　3、GJIC參與調節(jié)鈣離子通路介導的鎘致大鼠肝臟毒性損傷
　　為了探討鈣離子通路在鎘致大鼠肝細胞損傷中的作用

8、以及紅景天苷的保護機制，本試驗通過體外添加鈣離子通路相關抑制劑，用流式細胞術檢測BRL3A細胞內鈣離子濃度、免疫印跡法檢測BRL3A細胞鈣離子通路相關蛋白、實時定量PCR檢測鈣離子通路相關基因表達、RTCA檢測細胞指數(shù)。結果表明，鎘能引起B(yǎng)RL3A細胞[Ca2+]i升高(p＜0.01)，通過添加細胞內游離鈣離子螯合劑BAPTA-AM可抑制鎘導致的細胞指數(shù)和細胞存活率的下降，添加Sal也有類似的作用。用EGTA螯合細胞外鈣離子可抑制鎘介導

9、的胞存活率的下降，內質網(wǎng)鈣泵抑制劑TG可促進鎘介導的細胞存活率的下降(p＜0.01或p＜0.05)。體內和體外試驗都表明鎘能下調CaM mRNA的表達，說明CaM參與了重金屬鎘對肝細胞的毒性損傷過程。GJIC抑制劑GA單獨處理可引起細胞[Ca2+]i升高，GA還進一步促進鎘致BRL3A細胞鈣超載，細胞外鈣離子螯合劑EGTA可部分抑制鎘誘導的BRL3A細胞[Ca2+]i升高，但EGTA與GA聯(lián)合則惡化鎘誘導的BRL3A細胞[Ca2+]i升

10、高，TG單獨處理就能引起[Ca2+]i的升高以及細胞成活率下降，與鎘聯(lián)合則進一步加劇對細胞的損傷作用(p＜0.01)。表明GJIC與鈣離子通路關系密切，誘導細胞[Ca2+]i升高是鎘發(fā)揮細胞毒性的重要途徑，鎘引起的肝細胞鈣超載主要是由于鎘誘導細胞內鈣庫（尤其是內質網(wǎng)）的釋放導致的，Sal可作為保護劑通過GJIC與鈣離子通路發(fā)揮對鎘致肝細胞毒性損傷的保護作用。
　　4、GJIC參與調節(jié)MAPK通路介導的鎘致大鼠肝臟毒性損傷
　

11、　為了探討鎘致大鼠肝細胞損傷中MAPK通路與GJIC的交互作用以及紅景天苷的保護機制，本試驗通過體外添加MAPK通路相關抑制劑，如ERK制劑U0126、JNK制劑SP600125、p38抑制劑SB202190，同時結合保護劑Sal、GJIC抑制劑GA，用染料劃痕示蹤法檢測GJIC，免疫印跡法檢測BRL3A細胞MAPK通路相關蛋白表達，實時定量PCR檢測Cx32基因表達;RTCA檢測細胞指數(shù)，Transwell共培養(yǎng)體系觀察MAPK通路在

12、鎘暴露受損肝細胞通過GJIC對正常肝細胞損傷的影響。結果表明，鎘致BRL3A細胞以及大鼠肝細胞發(fā)生毒性損傷過程中MAPK關鍵信號分子ERK、JNK、p38MAPK發(fā)生磷酸化，通過添加Sal可以明顯抑制ERK、JNK、p38MAPK蛋白的活化進而減輕鎘的細胞毒性損傷作用。添加相關抑制劑發(fā)現(xiàn)，抑制ERK以及p38MAPK蛋白磷酸化可明顯抑制鎘誘導的BRL3A細胞指數(shù)的下降，抑制JNK磷酸化則對細胞指數(shù)的影響較小。抑制MAPKs的活化可上調C

13、x32mRNA的表達和Cx43蛋白的表達，改善鎘誘導的GJIC的抑制作用，同時對鎘損傷細胞通過GJIC對正常細胞的毒性損傷作用具有明顯的保護作用。而抑制GJIC對鎘誘導BRL3A細胞MAPK通路的激活幾乎無影響。
　　5、細胞縫隙連接通訊在鎘誘導大鼠肝細胞自噬中的作用為了探討鎘引起的自噬與GJIC的關系，本研究通過體外添加自噬特異性抑制劑羥氯喹(CQ)以及自噬誘導劑雷帕霉素（RAP），同時結合GJIC抑制劑甘珀酸(CBX)，用單丹

14、磺酰尸胺(MDC)染色法觀察晚期自噬溶酶體，免疫印跡法檢測自噬蛋白LC3、連接蛋白Cx43的表達，實時定量PCR檢測自噬相關基因Atg-5、Atg-7、Beclin-1表達，探討鎘暴露大鼠肝細胞過程中自噬與GJIC的變化。結果表明，MDC染色證實了鎘誘導BRL3A細胞發(fā)生自噬，同時自噬相關基因Beclin-1、Atg5、Atg7表達上調(p＜0.01)，LC3-Ⅱ蛋白表達增多，并具有明顯的劑量-效應關系(p＜0.01)。抑制自噬可進一步