縫隙連接在損傷血管修復中作用的實驗研究.pdf

1、研究背景： 血管損傷性疾病如動脈粥樣硬化、高血壓及糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)病率正逐年升高，是僅次腫瘤的的第二大致死因素，嚴重威脅著人類的健康。機械、炎性等損傷因素損傷血管內(nèi)皮后可誘導炎性細胞浸入、血管平滑肌細胞增殖，最終導致粥樣硬化、斑塊破裂及血管再狹窄，是粥樣硬化斑塊形成的始動因素，也是血管損傷后不良修復反應的主要原因之一。內(nèi)皮細胞損傷后，在生長因子、化學因子、切應力刺激及炎性介質(zhì)等因素的作用下，血管平滑肌細胞由血管中層向內(nèi)膜遷移

2、、增殖、合成及分泌細胞外基質(zhì)等是血管不良修復、新生內(nèi)膜過度增生的病理生理學基礎(chǔ)，也是動脈粥樣硬化、再狹窄等血管損傷性疾病發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。抑制血管平滑肌的遷移、增殖是防治血管損傷性疾病的重要措施之一。因此，探討血管平滑肌遷移、增殖的自身內(nèi)在機制，從而尋找抑制血管平滑肌細胞遷移、增殖的措施，將會為血管損傷性疾病的防治提供新的策略。 研究目的： 縫隙連接介導的細胞間直接通訊可能在血管損傷修復中具有重要作用。本研究擬觀察縫

3、隙連接在內(nèi)皮損傷修復、血管平滑肌細胞增殖及表型轉(zhuǎn)化中的作用，并觀察縫隙連接在血管損傷后新生內(nèi)膜過度增生中的作用。另外，通過建立血管內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞雙層共培養(yǎng)模型以觀察縫隙連接在內(nèi)皮細胞與血管平滑肌細胞相互調(diào)節(jié)中的作用，并初步探討在內(nèi)皮細胞與血管平滑肌細胞相互調(diào)節(jié)的過程中通過縫隙連接傳遞的信號介質(zhì)及可能的機制，從而為尋找血管損傷性疾病的防治新策略提供實驗依據(jù)。 研究方法： 1.為了探討內(nèi)皮縫隙連接在介導細胞間通訊及在損

4、傷血管內(nèi)皮修復中的作用，本實驗采用植塊法培養(yǎng)大鼠主動脈內(nèi)皮細胞，并用抗vWF免疫熒光染色及透射電鏡觀察來鑒定培養(yǎng)的大鼠主動脈內(nèi)皮細胞，AnnexinⅤ/PⅠ染色及流式細胞檢測技術(shù)來檢測內(nèi)皮細胞凋亡，用體外血管新生試劑盒分析內(nèi)皮細胞體外成管能力，細胞免疫熒光染色法檢測大鼠主動脈內(nèi)皮細胞縫隙連接蛋白37、40及47的表達，熒光漂白后恢復技術(shù)檢測縫隙連接介導的細胞間通訊。機械劃痕建立內(nèi)皮損傷模型，每24h攝像一次以定量分析內(nèi)皮損傷修復速度，并

5、觀察縫隙連接特異性阻斷劑18α-甘草次酸(18α-GA)對內(nèi)皮損傷后修復的影響。 2.為探討縫隙連接阻斷劑對大鼠血管平滑肌細胞增殖及表型轉(zhuǎn)化的影響，本實驗采用貼塊法培養(yǎng)大鼠主動脈平滑肌細胞，采用抗SMα-actin免疫熒光染色鑒定平滑肌細胞，細胞免疫熒光染色法及westernblot檢測大鼠主動脈平滑肌細胞縫隙連接蛋白43的表達，熒光漂白后恢復技術(shù)檢測縫隙連接介導的細胞間通訊，四唑鹽比色法測定細胞增殖能力以及采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式

6、反應檢測平滑肌α-肌動蛋白的表達，并觀察縫隙連接特異性阻斷劑觀察18α-GA對上述指標的影響。 3.為了觀察縫隙連接在調(diào)節(jié)血管張力及在血管損傷修復中的作用，本實驗取大鼠主動脈制成血管環(huán)分別測量在18α-GA作用前后血管環(huán)對NE和Ach反應性的變化，建立大鼠頸動脈損傷模型，給予生胃酮3mg/kg/d腹腔注射，對照組給予生理鹽水腹腔注射(2ml/d)，14天后處死動物，取目標血管段，用HE及DAPI-伊文思藍染色觀察新生內(nèi)膜厚度，細

7、胞免疫熒光染色法及westernblot檢測靶血管縫隙連接蛋白43的表達。 4.為了探討鈣離子跨縫隙連接在內(nèi)皮細胞與平滑肌細胞間的傳遞及其意義，本實驗采用前述的植塊法分別培養(yǎng)大鼠主動脈內(nèi)皮及平滑肌細胞，建立內(nèi)皮細胞與平滑肌細胞雙層共培養(yǎng)模型，并用透射電鏡觀察兩種細胞在transwellinsert膜兩側(cè)生長情況，然后3H-TdR摻入法觀察平滑肌細胞的增殖情況，將細胞負載Fluo-3后，在用ETA(10-5M)和/或ETB(10-

8、5M)受體阻斷劑處理一種細胞后用ET-1(10-7M)刺激另一種細胞在激光共聚焦顯微鏡測定未刺激細胞內(nèi)熒光強度變化，并觀察18α-GA及肝素對上述變化的影響。用RT-PCR測定在上述處理中刺激內(nèi)皮細胞后平滑肌細胞內(nèi)c-fos及c-junmRNA表達的變化。 主要結(jié)果： 1.內(nèi)皮縫隙連接在介導細胞間通訊及在損傷血管內(nèi)皮修復中的作用：成功培養(yǎng)了大鼠主動脈內(nèi)皮細胞，vWF免疫熒光染色陽性、透射電鏡觀察可見WP小體。在內(nèi)皮細胞中

9、縫隙連蛋白37、40及47中均有表達。熒光物質(zhì)能夠通過縫隙連接在相鄰細胞間進行傳遞，孤立細胞熒光恢復率顯著低于相鄰細胞(5.7±0.63％vs.82.26±1.68％，P＜0.01)：而18α-GA能夠抑制縫隙連接介導的細胞間通訊，18α-GA組的熒光恢復率顯著低于對照組(33.58±1.73％vs.82.26±1.68％，P＜0.01)。18α-GA可抑制內(nèi)皮細胞的體外成管能力，與正常對照組相比有顯著性差異(4.12±0.41vs.2

10、.32±0.58，P＜0.01)。 2.縫隙連接阻斷劑對大鼠血管平滑肌細胞增殖及表型轉(zhuǎn)化的影響：成功培養(yǎng)了大鼠主動脈平滑肌細胞，SMα-actin免疫熒光染色陽性。大鼠血管平滑肌細胞體外培養(yǎng)3天后可表達縫隙連接蛋白43。熒光物質(zhì)能夠通過縫隙連接在相鄰細胞間進行傳遞，孤立細胞熒光恢復率顯著低于相鄰細胞(7.3±0.58％vs.80.61±6.57％，P＜0.01)；而18α-GA能夠抑制縫隙連接介導的細胞間通訊，18α-GA組的熒

11、光恢復率顯著低于對照組(41.43±7.62％vs.80.61±6.57％，P＜0.05)。 3.縫隙連接在調(diào)節(jié)血管張力及在血管損傷修復中的作用：單純給予18α-GA處理血管環(huán)并未出現(xiàn)明顯的收縮或舒張反應。在對照組中，給予去甲腎上腺素或乙酰膽堿后，血管環(huán)發(fā)生明顯的收縮或舒張反應，而經(jīng)18α-GA預處理后，去甲腎上腺素或乙酰膽堿引起的血管環(huán)收縮或舒張反應幅度顯著降低(NE:0.60±0.03vs.0.21±0.04；Ach:0.1

12、5±0.01vs.0.62±0.03；P＜0.05)。損傷2周生胃酮干預組血管血管新生內(nèi)膜明顯減輕，血管腔狹窄較單純損傷組輕。用新生內(nèi)膜細胞核計數(shù)的方法評價新生內(nèi)膜形成情況顯示，生胃酮干預組新生內(nèi)膜細胞核數(shù)量顯著低于對照組(89±28.40vs.236±15.04，n=5，P＜0.01)。在球囊損傷后2周后血管組織切片免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，在形成的新生內(nèi)膜中免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)縫隙連接蛋白Cx43表達豐富。Westernblot結(jié)果顯示，對照組

13、縫隙連接蛋白Cx43的表達顯著高于生胃酮干預組(0.93±0.06vs.0.38±0.11，n=3，P＜0.01)。 4.鈣離子跨縫隙連接在內(nèi)皮細胞與平滑肌細胞間的傳遞：在共培養(yǎng)后第一天，EC/SMC組及SMC/SMC組平滑肌細胞3H-TdR摻入相比并無統(tǒng)計學差異(10900±1320cpm/well10430±1200，P＞0.05)。第二天，EC/SMC組平滑肌細胞3H-TdR的摻入就明顯小于SMC/SMC組(17200±1

14、734cpm/wellvs.20900±1659cpm/well)，兩者差異未達到統(tǒng)計學標準。到第三天這種差異更加明顯，EC/SMC組平滑肌細胞3H-TdR的摻入為25800±1984cpm/well，SMC/SMC組的則為33070±3569cpm/well，兩者相比有顯著性差異(P＜0.05)。在用18α-GA預處理24h后，EC/SMC共培養(yǎng)第三天后平滑肌細胞3H-TdR的摻入為明顯高于未處理EC/SMC組，兩者相比有顯著性差異(

15、30500±2650cpm/wellvs.25800±1984cpm/well，P＜0.05)。在內(nèi)皮細胞與平滑肌細胞雙層共培養(yǎng)體系中，用ET-1刺激上層的內(nèi)皮細胞，下層平滑肌細胞內(nèi)游離鈣濃度顯著升高，與加藥前相比有顯著差異。加入18α-GA以阻斷雙層細胞間的肌內(nèi)皮連接后，可抑制平滑肌細胞內(nèi)游離鈣濃度的升高(P＜0.01)。而用肝素處理平滑肌細胞則對細胞內(nèi)游離鈣濃度無顯著影響(P＞0.05)。用ET-1刺激平滑肌細胞，下層內(nèi)皮細胞內(nèi)游離

16、鈣濃度顯著升高，與加藥前相比有顯著差異。加入18α-GA以阻斷雙層細胞間的肌內(nèi)皮連接后，可抑制平滑肌細胞內(nèi)游離鈣濃度的升高(P＜0.01)。用肝素處理內(nèi)皮細胞后可抑制細胞內(nèi)游離鈣濃度升高的幅度，但不能完全阻斷其升高。在刺激內(nèi)皮細胞后，平滑肌細胞內(nèi)c-fos及c-junmRNA表達顯著增加，與未刺激內(nèi)皮細胞相比有顯著性差異(c-fos:0.957±0.051vs.0.682±0.038；c-jun:0.816±0.054.vs.0.467

17、±0.032；P＜0.01)。 全文結(jié)論： 1.內(nèi)皮細胞間存在縫隙連接介導的細胞間通訊，而這種通訊能夠調(diào)節(jié)內(nèi)皮損傷后的修復過程。 2.縫隙連接介導的細胞間直接通訊能夠調(diào)節(jié)平滑肌細胞的增殖能力以及平滑肌細胞由合成型向收縮型的轉(zhuǎn)化。 3.縫隙連接在生理條件下參與維持及調(diào)節(jié)血管張力，在病理條件能夠促進血管損傷后新生內(nèi)膜的過度增生，在血管損傷性疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用。 4.鈣離子能跨縫隙連接在