IL-17調(diào)控肝細(xì)胞參與肝臟損傷與修復(fù).pdf

1、【背景】肝纖維化是肝臟受到各種急慢性刺激后引發(fā)的損傷修復(fù)反應(yīng)。導(dǎo)致肝纖維化的主要病因有慢性病毒性肝炎、酒精性肝病以及非酒精性脂肪肝等。若損傷因素持續(xù)存在,導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)不斷聚集,肝纖維化逐步進(jìn)展為肝硬化。一旦發(fā)展為肝硬化,其并發(fā)癥多、預(yù)后差、死亡率高,嚴(yán)重危害人類健康。因此,肝硬化的發(fā)生機(jī)制受到越來越多的關(guān)注。大量研究顯示細(xì)胞因子(如TGF-β1、TNF-α、PDGF)、肝星狀細(xì)胞、枯否細(xì)胞等均參與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展,但是不能完全解釋肝

2、纖維化的發(fā)病機(jī)制。近年來有文獻(xiàn)報(bào)道,白細(xì)胞介素17(Interleukin-17,IL-17)可以促進(jìn)肺纖維化。在多種肝臟疾病中,外周血IL-17升高并且與肝損傷的嚴(yán)重程度呈正相關(guān),如酒精性肝病、原發(fā)性膽汁性肝硬化、病毒性肝炎(尤其乙型病毒性肝炎)、非酒精性脂肪肝等。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),四氯化碳(Carbon tetrachloride,CCl4)誘導(dǎo)小鼠肝纖維化以及自然恢復(fù)過程中,外周血IL-17水平呈動(dòng)態(tài)變化且與肝纖維化程度密切相

3、關(guān);注射外源性的重組小鼠IL-17可以促進(jìn)肝損傷;抗小鼠IL-17抗體可以減輕CCl4誘導(dǎo)的肝損傷。目前IL-17在肝臟內(nèi)的表達(dá)水平尚不清楚。有研究證實(shí)IL-17可以直接激活肝星狀細(xì)胞、促進(jìn)枯否細(xì)胞分泌TGF-β1進(jìn)而促進(jìn)肝纖維化。占肝臟總體積80％的肝細(xì)胞是否受到IL-17的影響呢?有學(xué)者認(rèn)為IL-17可以減輕IFN-γ誘導(dǎo)肝細(xì)胞的凋亡,也有學(xué)者認(rèn)為IL-17對肝細(xì)胞不發(fā)揮作用。因此我們采用CCl4腹腔連續(xù)注射的方法誘導(dǎo)小鼠肝損傷模型

4、以及CCl4干預(yù)原代培養(yǎng)的小鼠肝細(xì)胞模型,探討小鼠肝損傷模型中肝臟內(nèi) IL-17變化情況、肝細(xì)胞表面白細(xì)胞介素17受體(Interleukin-17 recepter,IL-17R)的表達(dá)、IL-17對肝細(xì)胞的作用以及IL-17在肝細(xì)胞活化枯否細(xì)胞以及肝星狀細(xì)胞的作用。進(jìn)一步探討 IL-17在肝纖維化/肝硬化中的作用機(jī)制,有助于肝纖維化/肝硬化機(jī)制的闡明。
　　【目的】明確CCl4對小鼠肝內(nèi) IL-17表達(dá)的影響;確定IL-17對

5、肝細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制;探索IL-17在肝細(xì)胞活化枯否細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞中的作用。
　　【方法】(1)腹腔注射CCl48周以誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型,8 w后取小鼠肝臟、采集小鼠血清,前者用H&E染色以及天狼星紅染色方法檢測小鼠肝臟損傷程度以及肝纖維化程度,后者用全自動(dòng)生化分析儀檢測小鼠血清中ALB、AST以及ALT的水平;在肝纖維化造模過程中取造模小鼠肝臟組織,用ELISA方法檢測IL-17的表達(dá)水平;(2)分離小鼠肝細(xì)胞,用不同濃

6、度的重組小鼠IL-17因子(Recombinant Mouse IL-17,Rm IL-17)(5、10、15、20、25 ng/ml)干預(yù)肝細(xì)胞,分別在干預(yù)24 h、48 h、72 h后,用流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL方法檢測肝細(xì)胞凋亡;BrdU以及Ki-67方法檢測肝細(xì)胞增殖;ELISA檢測肝細(xì)胞分泌TGF-β1的水平。分離小鼠肝細(xì)胞,用6 mM的CCl4預(yù)處理肝細(xì)胞1 h用來建立體外肝細(xì)胞損傷模型,用上述不同濃度的Rm IL-17干預(yù)肝

7、細(xì)胞,在不同時(shí)間點(diǎn)檢測肝細(xì)胞凋亡、增殖以及分泌TGF-β1的水平,檢測方法同上。用流式細(xì)胞術(shù)檢測正常肝細(xì)胞以及體外損傷肝細(xì)胞表面 IL-17R的表達(dá)量;Western blot方法檢測Caspase-3以及Bcl-2的表達(dá)量;(3)用不同濃度的Rm IL-17干預(yù)正常肝細(xì)胞或CCl4體外損傷肝細(xì)胞,并分別與小鼠枯否細(xì)胞或肝星狀細(xì)胞共培養(yǎng),前者用ELISA以及Real-time PCR方法檢測TGF-β1以及TNF-α表達(dá)量;后者用Rea

8、l-time PCR方法檢測α-SMA、TGF-β1、基質(zhì)金屬蛋白酶3(MMP3)、金屬蛋白酶組織抑制劑1(TIMP1)和膠原層蛋白(Collagen-1)等肝纖維化相關(guān)因子的表達(dá)。
　　【結(jié)果】(1)腹腔注射CCl4第8 w時(shí),小鼠肝組織H&E染色和天狼星紅染色發(fā)現(xiàn)肝臟出現(xiàn)了顯著的纖維化,血生化檢測表明轉(zhuǎn)氨酶增高、白蛋白降低,提示成功建立了小鼠肝纖維化模型。
　　(2) ELISA檢測發(fā)現(xiàn),在CCl4誘導(dǎo)建立小鼠肝纖維化的

9、過程中,肝臟內(nèi)IL-17水平顯著升高,并具有時(shí)間依賴性。
　　(3)流式細(xì)胞術(shù)以及TUNEL染色表明:正常小鼠肝細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí),其自發(fā)性凋亡率為10%-15%。用CCl4處理原代培養(yǎng)的小鼠肝細(xì)胞,可誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡。在體外培養(yǎng)和誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的過程中,加入Rm IL-17,發(fā)現(xiàn)IL-17可以顯著抑制肝細(xì)胞的自發(fā)凋亡和CCl4誘導(dǎo)凋亡。
　　(4) BrdU以及Ki-67染色表明,IL-17對原代培養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞的增殖無明顯影響

10、。
　　(5) ELISA結(jié)果顯示,IL-17對原代培養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞分泌TGF-β1無明顯影響。
　　(6)流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn),正常小鼠肝細(xì)胞表達(dá)一定水平的IL-17R,CCl4可顯著提高IL-17R在肝細(xì)胞上的表達(dá)水平。
　　(7) Western blot表明,IL-17可以上調(diào)Bcl-2在肝細(xì)胞的表達(dá),并抑制Caspase-3的活化。
　　(8)小鼠肝細(xì)胞與枯否細(xì)胞共培養(yǎng)可以誘導(dǎo)TGF-β1以及TNF-α的表

11、達(dá),經(jīng)IL-17預(yù)處理的肝細(xì)胞與枯否細(xì)胞共培養(yǎng),TGF-β1和TNF-α的表達(dá)量較對照組顯著降低。
　　(9)小鼠肝細(xì)胞與肝星狀細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)可以誘導(dǎo)α-SMA、TGF-β1、MMP3、Collagen-1以及TIMP1的表達(dá),經(jīng)IL-17預(yù)處理的肝細(xì)胞與肝星狀細(xì)胞共培養(yǎng),α-SMA、TGF-β1、MMP3、Collagen-1以及TIMP1的表達(dá)量較對照組顯著降低。
　　【結(jié)論】在CCl4誘導(dǎo)小鼠肝損傷的過程中,肝內(nèi)IL-1