小膠質細胞對神經損傷環(huán)境中MSCs生物學行為的影響及其信號傳導通路初探.pdf

1、神經系統(tǒng)的損傷常常造成神經元不可逆的死亡，由此引起的神經功能喪失一直是困擾神經病學家的難題。近來干細胞被應用于神經損傷后的組織修復與功能重建，為這一難題的解決提供了新的思路。研究表明MSCs(Marrowmesenchymalstemcells，骨髓間充質干細胞)具有取材方便、容易分離獲取、適宜條件下可以跨胚層分化、移植免疫排斥弱等特點，成為神經細胞移植治療研究中最活躍的領域，已經在動物實驗中取得良好療效。在這一過程中，免疫系統(tǒng)處于何種

2、地位，其對干細胞移植后分化、增殖、神經營養(yǎng)等生物學行為有何影響等問題尚無明確答案。小膠質細胞被認為是中樞神經系統(tǒng)中最有代表性的免疫細胞，在不同環(huán)境下小膠質細胞可以分泌神經營養(yǎng)因子或神經毒性因子，對損傷神經細胞的修復或死亡起直接的促進作用，在腦缺血、帕金森氏病、阿爾茨海默病等多種中樞神經系統(tǒng)病變中發(fā)揮損傷和修復的雙重作用。本研究以小膠質細胞為切入點，重點考察其在神經損傷的微環(huán)境中對MSCs的增殖、分化、神經營養(yǎng)等多種生物學行為的影響并對在

3、此環(huán)境下MSCs內部的信號傳導通路進行初步研究。 本研究通過實驗得出如下結果： 1、骨髓間充質干細胞的培養(yǎng)與鑒定：MSCs原代培養(yǎng)第二天換液后，細胞呈圓形、發(fā)亮，散在貼壁分布，一周后呈纖維狀密集生長。在細胞覆蓋約80％培養(yǎng)瓶底時傳代，傳至第2-3代時應用免疫熒光方法鑒定MSCs標志抗原CD44，熒光鏡下見陽性細胞呈淡綠色熒光，在同一視野下觀察明視野下細胞生長，同熒光視野相比較，95％以上細胞為CD44陽性細胞。

4、PC12細胞株引進后培養(yǎng)初期，呈成簇狀、多角形懸浮生長，傳代7-8代以上，部分細胞呈分化趨勢，表現(xiàn)為突起出現(xiàn)，并貼壁生長。BV2細胞株生長較迅速，細胞呈梭形、貼壁生長。 2、我們采用神經元特異性烯醇化酶(Neuronspecificenolase，NSE)進行免疫熒光染色以確定具有神經元分化趨勢的細胞。熒光顯微鏡下見NSE陽性細胞體積較其它細胞略大，形態(tài)不一，多數(shù)有1-3個長突起，呈神經元細胞的形態(tài)。其中，D組(與BV2共育并同

5、時接受受損PC12上清刺激的MSCs)及B組(僅接受受損PC12上清刺激的MSCs)可見相對其它組較明顯的NSE陽性細胞散在分布，而其他組中鏡下呈黑暗視野。計數(shù)全部各孔的NSE陽性細胞，經MSCs增殖度標準化(NSE陽性細胞數(shù)/MTT)后比較各組NSE陽性細胞表達，D組為最高，同對照組相比有顯著差異(P＜0.05)。而B組次之，也較對照組顯著增高(P＜0.05)，但同D組相比無統(tǒng)計學差異。 3、MTT法檢測各組MSCs數(shù)量的結果

6、顯示：D組(受損PC12上清孵育及BV2共育組)MSCs數(shù)量最高，同對照組相比差異顯著(P＜0.05)，有BV2共育的C組、D組分別同無BV2共育的A組、B組相比，其MSC數(shù)量較后者增高，其中D組比B組顯著增高(P＜0.05)。 4、以MSCs上清孵育損傷PC1224小時后，檢測PC12的凋亡率。結果發(fā)現(xiàn)各實驗組之間PC12凋亡率出現(xiàn)顯著差別，以D組(受損PC12上清及與BV2共育的MSCs培養(yǎng)上清組)凋亡細胞數(shù)最少，同對照組相

7、比差異顯著(P＜0.05)，而B組(受損PC12上清處理的MSCs培養(yǎng)上清組)凋亡細胞數(shù)次之，但與對照組相比無統(tǒng)計學差異。D組凋亡細胞數(shù)明顯少于B組(P＜0.05)。 5、MSCs培養(yǎng)上清神經營養(yǎng)因子檢測：僅TGF-β在各組中均能檢測到，而TGF-β在D組的表達同對照組相比有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。BD-NF、NGF在所有五組中均未達到檢測水平。 6、對MSCs細胞中磷酸化STAT3與總STAT3的檢測表明：D組ST

8、AT3的磷酸化激活程度同其它組相比有明顯差異(P＜0.05)，提示在有損傷神經細胞及小膠質細胞共同參與時，MSCs的生物學行為(如神經營養(yǎng)、分化、增殖)啟動或進行過程中，有STAT3的活躍參與。經磷酸化STAT3與MSCs增殖及分化的相關性檢驗發(fā)現(xiàn)，盡管二者的相關性均無統(tǒng)計學意義，但磷酸化STAT3同增殖的相關系數(shù)更高，有可能同增殖存在一定關系。 討論：免疫反應在神經系統(tǒng)疾病中常有廣泛參與，又常常是神經變性或神經損傷的病理機制，

9、因而勢必對進入神經系統(tǒng)進行營養(yǎng)或替代治療的干細胞產生重要的影響，如WongG等的研究就發(fā)現(xiàn)IFN可以促進神經干細胞的分化和神經突起的生長。小膠質細胞被認為是由血液中單核細胞或多能單核前體細胞演變而來，是腦內免疫功能的重要執(zhí)行者，在中樞神經系統(tǒng)病變時可以發(fā)揮損傷和修復的雙重作用。而關于其對干細胞分化增殖或神經營養(yǎng)功能的影響尚未見報道。本研究以小膠質細胞(BV2)為切入點，重點研究在神經損傷的微環(huán)境下，小膠質細胞對MSCs生物學行為的影響。

10、 BV2和PC12分別是小鼠的小膠質細胞瘤細胞和嗜鉻細胞瘤細胞，二者已經被廣泛用來替代小膠質細胞和神經細胞進行研究。PC12經老化Aβ1-40損傷后能分泌各種損傷相關的因子，而損傷PC12的上清與MSCs、BV2一起模擬構成了腦內神經損傷的部分微環(huán)境。實驗結果表明：損傷PC12上清孵育的干細胞中NSE表達較正常PC12上清或對照組增多，提示神經細胞損傷后能通過其分泌的因子作用于干細胞，誘導干細胞向神經元的分化。而正常PC12上清

11、孵育的MSCs的NSE表達與對照組相比沒有統(tǒng)計學差異，提示神經細胞損傷是啟動干細胞定向分化的必要條件。在BV2存在時，NSE陽性的干細胞在數(shù)量上多于未與BV2共育者，但在統(tǒng)計學上沒有差異。說明小膠質細胞至少對干細胞向神經元細胞的分化沒有明顯的負面影響。在小膠質細胞存在時(C組、D組)，不論孵育上清來自于損傷或正常的PC12，MSCs的增殖均高于無BV2共育組(A組、B組)，其中D組較B組有顯著提高(P＜0.05)，提示小膠質細胞可以促進

12、MSC增殖。以上提示受損神經細胞的存在同分化的關系更密切，而小膠質細胞主要影響了MSC的增殖行為。 我們又檢測了小膠質細胞對干細胞在神經損傷微環(huán)境中神經營養(yǎng)功能或神經毒性功能的影響。我們以MSCs分泌的上清孵育經老化Aβ1-40損傷的PC12，再檢測損傷PC12的凋亡率，來考察MSC上清的神經營養(yǎng)或神經毒性水平。結果發(fā)現(xiàn)：在損傷PC12上清孵育下，與BV2共育的MSCs分泌的上清能顯著降低損傷PC12的凋亡，與對照組相比有顯著差

13、異(P＜0.05)。其他各組間PC12凋亡率沒有明顯差別。提示：BV2在神經損傷環(huán)境中的存在能促進MSCs的神經營養(yǎng)功能，提高損傷神經細胞的存活力，則BV2此時發(fā)揮著間接的神經保護功能。我們又進一步檢測了MSCs上清中神經營養(yǎng)因子的存在，包括BDNF(Brainderivedneurotrophicfactors，腦源性神經營養(yǎng)因子)，TGF-β(轉化生長因子-β)，NGF(nervegrowthfactors，神經生長因子)。結果發(fā)現(xiàn)

14、：所有組均能檢測到TGF-β，而與BV2及損傷PC12上清共育的MSCs所分泌的上清中TGF-β分泌最高，與對照組相比有明顯差異(P＜0.05)，而BDNF、NGF在所有組中均未達到檢測水平。該結果提示：BV2有可能通過增加MSCs中TGF-β的分泌而促進了MSCs的神經營養(yǎng)功能。 MSCs在神經損傷微環(huán)境下的生物學行為決定了它是否能挽救或替代損傷神經細胞，而MSCs內部信號的傳導是其生物學行為轉變的基礎。我們收集了MSCs的細

15、胞溶漿，對總STAT3及磷酸化STAT3進行了檢測。結果表明：各組的總STAT3差異不大，而磷酸化STAT3在與損傷PC12上清及BV2共育的MSCs組有顯著提高(P＜0.05)，提示該組MSCs的各種生物學行為中有STAT3的活躍參與，盡管磷酸化STAT3與MSCs增殖及分化的相關性檢測的統(tǒng)計學意義均不顯著，但磷酸化STAT3與MSCs增殖之間具有更高的相關系數(shù)，不排除在本實驗設計的微環(huán)境中，磷酸化STAT3同增殖的關系較分化更密切。

16、 本實驗結果表明小膠質細胞能影響神經損傷微環(huán)境中MSCs的生物學行為，使其向支持修復神經損傷的方向轉變。而在此環(huán)境中，小膠質細胞的行為有何變化，通過何種途徑影響MSCs的生物學行為尚未觸及，有待進一步探討。 結論： 1、在神經損傷環(huán)境下，小膠質細胞的存在有利于MSCs增殖，并對向神經元細胞的分化無負面影響。 2、神經損傷微環(huán)境下，小膠質細胞的存在能促進MSCs的神經營養(yǎng)功能，提高神經營養(yǎng)因子的生成。