顱底軟骨細(xì)胞體外循環(huán)張應(yīng)變加載研究.pdf

1、目的：建立體外培養(yǎng)大鼠顱底軟骨細(xì)胞的方法，并進(jìn)行體外周期性張應(yīng)變（Cyclic tensile strain，CTS）加載，研究CTS對顱底軟骨細(xì)胞合成胞外基質(zhì)的影響及CTS加載后miRNA的表達(dá)差異。
　　方法：采用兩步酶消化法分離培養(yǎng)1周齡SD大鼠顱底軟骨細(xì)胞，采用SABC法檢測Ⅱ型膠原及 Sox9的表達(dá)來鑒定軟骨細(xì)胞，定量分析傳代過程中 Sox9、Col1a1、Col2a1、Col10a1 mRNA的表達(dá)變化及COL2A1、

2、SOX9蛋白的表達(dá)變化。采用FX-5000TM細(xì)胞張應(yīng)力加載系統(tǒng)對P2代軟骨細(xì)胞施加1Hz、10%延伸率、sin波形的CTS，加力時間為24h。對照組在同一時間靜置培養(yǎng)于細(xì)胞加力板。定量分析加力組與對照組內(nèi)有關(guān)基因的表達(dá)差異及COL2A1、SOX9蛋白的表達(dá)差異。使用Illumina公司的HiSeqTM2000對加力組及對照組顱底軟骨細(xì)胞進(jìn)行miRNA深度測序，包括cDNA文庫制備、簇生成、上機(jī)測序3個主要步驟，通過數(shù)據(jù)分析獲得差異表達(dá)

3、的miRNA。
　　結(jié)果：體外培養(yǎng)的顱底軟骨細(xì)胞4代以內(nèi)II型膠原及Sox9的免疫組化均呈強(qiáng)陽性；Col2a1及Sox9的表達(dá)在P1代降低、P2代回升，并在P3、P4代維持穩(wěn)定；Col1a1至P3代開始大幅上升；COL2A1及SOX9蛋白在P0及P4代細(xì)胞中均有表達(dá)，P1代細(xì)胞表達(dá)量略低于P2代細(xì)胞。P2代顱底軟骨細(xì)胞加力后，Acan、Col2a1及Col10a1的表達(dá)均較對照組升高（P<0.05），Sox9和Ihh的表達(dá)較對照組

4、升高（P<0.05），PTHrP的表達(dá)基本沒有變化（P>0.05）。COL2A1和SOX9蛋白的表達(dá)均較對照組升高。深度測序結(jié)果獲得24條差異表達(dá)的miRNA（P<0.05），其中14條表達(dá)下調(diào)，10條表達(dá)上調(diào)，miR-140-5p和 miR-125b-5p是兩條最有可能起作用的miRNA。
　　結(jié)論：本研究成功分離和培養(yǎng)了顱底軟骨細(xì)胞，P2、P3、P4代細(xì)胞均可用于后續(xù)實驗，以P2代最佳。1Hz、10%延伸率的CTS有促進(jìn)顱底軟