骨髓瘤細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSCs)相互作用過程中對BMMSCs生物學(xué)特性影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：研究多發(fā)性骨髓瘤(Multiple myeloma,MM)細(xì)胞與人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)在體外共培養(yǎng)過程中,誘導(dǎo)BMMSCs成骨的情況以及相關(guān)基因DKK1、Decorin、Collagen1、Smad5的表達(dá)情況。探討體外骨髓瘤細(xì)胞能否誘導(dǎo)正常的BMMSC出現(xiàn)類似骨髓瘤病人BMMSC異常,為進(jìn)一步闡明MM發(fā)病機(jī)制、探索MM新的臨床治療靶點(diǎn)提供理論和實(shí)驗(yàn)

2、基礎(chǔ)。
　　 方法：⑴以分離和培養(yǎng)的正常第3代BMMSCs作為研究對象。實(shí)驗(yàn)分為2組:①以BMMSCs單獨(dú)培養(yǎng)第5、8、12天組為對照組；②以與U266細(xì)胞共培養(yǎng)第5、8、12天三個時間點(diǎn)的BMMSCs作為實(shí)驗(yàn)組。⑵與U266細(xì)胞共培養(yǎng)的BMMSCs細(xì)胞,分別于第5、8、12天倒置顯微鏡下檢測生長狀況、形態(tài)和細(xì)胞數(shù)目,比較實(shí)驗(yàn)組與對照組BMMSCs細(xì)胞增殖能力的變化情況。⑶分別在BMMSCs單獨(dú)培養(yǎng)及與U266細(xì)胞共培養(yǎng)五天后加

3、入用含地塞米松(10-8 mol/L)、維生素C(0.05g/L)和β-甘油磷酸鈉(10-2mol/L)的L-DMEM成骨條件培養(yǎng)液,誘導(dǎo)BMMSCs向成骨細(xì)胞(Osteoblasts,OB)分化,于誘導(dǎo)第14天,取BMMSCs分別進(jìn)行堿性磷酸酶(ALP)和AlizarinRed染色以檢測BMMSCs的OB形成能力。⑷在對照組BMMSCs及實(shí)驗(yàn)組BMMSCs第5、8、12天終止培養(yǎng),提取總RNA,Real-TimePCR法測定BMMSC

4、s中DKK1、Decorin、Collagen1、Smad5 mRNA表達(dá)水平,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)果：①倒置顯微鏡下觀察,實(shí)驗(yàn)組及對照組BMMSCs形態(tài)均以長梭形為主,呈貼壁生長,對照組及實(shí)驗(yàn)組BMMSCs一般形態(tài)無顯著差異。在共培養(yǎng)的過程中,BMMSCs的增殖能力無顯著變化。②成骨誘導(dǎo)后的第14天,檢測BMMSCs成骨能力,經(jīng)Alizarin Red染色及ALP染色后結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組與對照組BMMSCs均可在成骨誘導(dǎo)

5、培養(yǎng)過程中向成骨細(xì)胞分化,但與U266細(xì)胞共培養(yǎng)來源的BMMSCs成骨分化潛能較差,礦化基質(zhì)沉積減少。③Realtime-PCR結(jié)果顯示:同對照相比,與U266細(xì)胞共培養(yǎng)的BMMSCs細(xì)胞,其Collagen1、Decorin、DKK1和Smad5的基因表達(dá)有顯著的變化：Collagen1基因在對照組第5、8、12天表達(dá)的相對拷貝數(shù)均值分別為50.2382±16.1061、42.2650±9.5823和57.9167±17.0791.實(shí)

6、驗(yàn)組第5、8、12天表達(dá)的相對拷貝數(shù)均值分別為19.8600±6.8429、20.8633±7.6858和15.8267±6.3454,且與對照組比較均顯著降低(P均<0.05)；Decorin基因在對照組第5、8、12天表達(dá)的相對拷貝數(shù)均值分別為14.8414±3.0398、15.6800±3.0845和12.9086±2.6157,實(shí)驗(yàn)組第5、8、12天表達(dá)的相對拷貝數(shù)均值分別為4.6657±0.9456、5.9857±0.9894

7、和5.5714±0.9292,與對照組比較均顯著降低(P均<0.05)；Smad5基因在對照組第5、8、12天表達(dá)的相對拷貝數(shù)均值分別為5.2725±1.5321、11.5275±2.6250和7.2125±2.0749,實(shí)驗(yàn)組第5、8、12天表達(dá)的相對拷貝數(shù)均值分別為2.7125±1.4307、1.7125±0.2288和2.8325±0.82631實(shí)驗(yàn)組第5、8、12天基因表達(dá)水平較對照組顯著降低(P<0.05)；DKK1基因在對照

8、組第5、8、12天表達(dá)的相對拷貝數(shù)均值分別為2.4757±0.6017、8.8821±2.0199和3.5250±2.7964,實(shí)驗(yàn)組第5、8、12天表達(dá)的相對拷貝數(shù)均值分別為6.4537±1.3495、12.8947±7.9996和3.7819±1.3803；實(shí)驗(yàn)組5天較對照組顯著升高(P<0.05),第8、12天DKK1基因表達(dá)水平較對照組增高但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 結(jié)論：⑴與U266細(xì)胞共培養(yǎng)的BMMSCs

9、細(xì)胞,在5、8、12天內(nèi)形態(tài)無顯著變化。⑵與U266細(xì)胞共培養(yǎng)的BMMSCs細(xì)胞增殖能力較對照組無顯著變化,但其成骨細(xì)胞分化形成能力下降。⑶與U226細(xì)胞共培養(yǎng)后,BMMSCs細(xì)胞群體的DKK1基因表達(dá)水平上調(diào),Collagen1.、Decorin、Smad5基因表達(dá)下調(diào),表明在骨髓瘤疾病中骨髓瘤細(xì)胞有可能調(diào)節(jié)BMMSCs成骨相關(guān)基因表達(dá)水,使BMMSCs成骨能力下降。⑷U266共培養(yǎng)誘導(dǎo)骨髓微環(huán)境中BMMSCs生物學(xué)特性的改變,可能在