大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞與CBRH-7919肝癌細胞相互作用的研究.pdf

1、第一部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞旁分泌物質(zhì)對CBRH-7919肝癌細胞系增殖和侵襲能力的影響.
　　目的:
　　探討大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞旁分泌物質(zhì)對大鼠CBRH-7919肝癌細胞增殖和侵襲能力的影響。
　　方法:
　　分離Wistar大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)，鑒定后進行體外培養(yǎng)，流式細胞儀鑒定細胞表型，制備含有骨髓間充質(zhì)干細胞旁分泌物質(zhì)的條件培養(yǎng)基(BMSC-CM)，MTT比色法檢測BMSC-CM對CBRH

2、-7919肝癌細胞增殖的影響，流式細胞儀檢測BMSC-CM對CBRH-7919肝癌細胞周期的影響，ELISA檢測BMSC-CM對CBRH-7919肝癌細胞分泌AFP的影響，Transwell小室檢測BMSC-CM對CBRH-7919肝癌細胞侵襲能力的影響。
　　結(jié)果:
　　1.密度梯度離心法和貼壁細胞篩選法分離出的大鼠BMSCs，培養(yǎng)的第三代細胞呈明顯成纖維細胞狀，排列有一定的方向性，折光性強，貼壁生長，細胞表型為CD29+

3、CD44+CD34-CD45-。
　　2.MTT比色法結(jié)果顯示：25％、50％、75％及100％BMSC-CM組的CBRH-7919肝癌細胞吸光度值(A值)分別為0.395±0.050、0.459±0.079、0.501±0.084及0.566±0.099，各組顯著高于0％BMSC-CM組(0.277±0.064)(P<0.05)，隨著BMSC-CM濃度的增加，A值依次升高，呈濃度依賴性。
　　3.流式細胞儀結(jié)果顯示：25％

4、、50％、75％及100％BMSC-CM組的CBRH-7919肝癌細胞分裂增殖指數(shù)分別為20.773±1.342、21.838±1.368、23.503±1.568和26.486±2.124，各組顯著高于0％BMSC-CM組(16.653±0.847)(P<0.05)，隨著BMSC-CM濃度的增加，細胞分裂增殖指數(shù)依次升高。
　　4.ELISA結(jié)果顯示：25％、50％、75％及100％BMSC-CM組的CBRH-7919肝癌細胞分

5、泌的AFP值分別為12.562±0.071、14.660±0.106、16.397±0.058及23.196±0.137，均高于0％BMSC-CM組(3.143±0.033)(P<0.05)，可以看出隨著BMSC-CM濃度的增加，AFP的量依次升高。
　　5.Transwell小室侵襲實驗結(jié)果顯示：25％、50％、75％和100％BMSC-CM處理后，Transwell小室膜上CBRH-7919肝癌細胞數(shù)分別為22.000±1.3

6、09、56.750±1.669、70.000±1.309、99.620±1.847，均多于0％BMSC-CM組(9.375±1.061)(P<0.05)，隨著BMSC-CM濃度的增加，侵襲能力逐漸增加，呈濃度依賴性。
　　結(jié)論:
　　1.采用密度梯度離心法和貼壁細胞篩選法可以成功分離出大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，經(jīng)流式細胞儀鑒定細胞表型為CD29+CD44+CD34-CD45-；
　　2.大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞旁分泌物質(zhì)對CB

7、RH-7919肝癌細胞系的增殖和侵襲有一定的促進作用。
　　第二部分CBRH-7919肝癌細胞誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞向血管內(nèi)皮樣細胞分化的初步研究
　　目的:
　　探討CBRH-7919肝癌細胞是否可以誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)分化為血管內(nèi)皮樣細胞及其機制。
　　方法:
　　應(yīng)用1μm小孔的Transwell小室構(gòu)建BMSCs與CBRH-7919肝癌細胞的共培養(yǎng)模型，分3組：單獨BMSC組即上

8、層不接種細胞，僅在下層接種BMSCs，共培養(yǎng)組即上層為CBRH-7919肝癌細胞，下層接種BMSCs，含有抗VEGF抗體-Avastin的共培養(yǎng)組即在共培養(yǎng)組內(nèi)加入抗VEGF抗體-Avastin，48h和72h后，免疫熒光法檢測骨髓間充質(zhì)干細胞VEGFR2和CD31的表達，半固體培養(yǎng)基檢測BMSCs毛細血管樣結(jié)構(gòu)的形成。
　　結(jié)果:
　　1.單獨BMSC組48h和72h時CD31和VEGFR-2的表達均陰性，共培養(yǎng)組48h時

9、BMSC少量表達CD31和VEGFR2，陽性率分別為：(11.50±1.87)％和(12.33±1.37)％，72h時，CD31和VEGFR2表達明顯增多，陽性率分別為：(24.43±2.23)％和(24.86±0.69)％，而含Avastin的共培養(yǎng)組CD31和VEGFR-2表達一直均陰性。
　　2.單獨BMSC組48h和72h時均未見毛細血管樣結(jié)構(gòu)形成，共培養(yǎng)組48h時出現(xiàn)明顯的毛細血管樣結(jié)構(gòu)(8.00±0.05)個/高倍視野