人骨髓間充質(zhì)干細胞衰老過程中DNA損傷應答特性研究.pdf

1、正常細胞受到Hayflick限制,不能發(fā)生無限增殖,衰老成為其最終結局,現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)存在少部分細胞發(fā)生衰老逃逸,使這些基因組高度不穩(wěn)定的衰老細胞發(fā)生癌變。干細胞作為成體組織細胞更新來源,具有生存周期長的特點,容易受到各種內(nèi)外因素的作用,相比生命周期短的分化細胞受到更多的DNA損傷,容易導致?lián)p傷的大量積累,而干細胞具有強大的增殖和分化潛能,基因組的不穩(wěn)定更易引發(fā)衰老和癌變。為保證基因組的穩(wěn)定,防止惡性轉(zhuǎn)化,細胞存在一個龐大的網(wǎng)絡進行“糾錯

2、”,DNA修復就是其中一種重要機制。對DNA損傷應答機制的研究發(fā)現(xiàn),如果細胞DNA損傷應答異常,同樣會出現(xiàn)基因組不穩(wěn)定現(xiàn)象,使細胞易發(fā)生衰老和惡性轉(zhuǎn)化。已有文獻報道,衰老細胞DNA損傷修復基因表達下調(diào)及核型異常,而在對基因敲除鼠和人類基因缺陷病患者的研究中,也發(fā)現(xiàn)DNA損傷修復基因缺失的細胞出現(xiàn)早衰現(xiàn)象。由此,我們認為細胞衰老與DNA損傷應答,以及腫瘤的發(fā)生具有密切聯(lián)系。然而,衰老細胞的DNA損傷應答能力如何并無相關報道,所以我們提出推

3、斷:干細胞衰老過程中DNA損傷應答能力下降可能加速干細胞衰老并且使細胞功能下降,同時破壞細胞凋亡屏障,促發(fā)干細胞惡性轉(zhuǎn)化。
　　目的:
　　以氧化損傷和DNA雙鏈斷裂損傷為模型,觀察衰老細胞DNA損傷應答情況,探索DNA損傷應答異常是衰老細胞基因組不穩(wěn)定性的直接原因。
　　方法:
　　1.培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細胞,用流式細胞技術和定向誘導分化對細胞進行鑒定。2.衰老相關β-半乳糖苷酶檢測細胞衰老情況,BrdU摻入實

4、驗檢測細胞增殖情況,QPCR檢測衰老相關基因,建立體外培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細胞衰老模型。3.建立氧化損傷和DNA雙鏈斷裂損傷模型觀察細胞DNA損傷和損傷后應答情況。通過CCK-8法檢測細胞存活情況檢測細胞對損傷的敏感性,DCFH-DA熒光探針檢測細胞內(nèi)活性氧,單細胞凝膠電泳和γH2AXfoci觀察細胞DNA損傷和損傷后應答情況,QPCR檢測參與損傷后應答相關基因的表達情況。
　　結果與結論:
　　1.人骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)長期體

5、外培養(yǎng)至40代以后,衰老相關β-半乳糖苷酶染色陽性細胞明顯增多,增殖能力明顯下降,衰老相關基因表達增高,提示間充質(zhì)干細胞長期培養(yǎng)后發(fā)生衰老。2.生存曲線結果顯示H2O2作用下,年輕間充質(zhì)干細胞存活率明顯高于衰老間充質(zhì)干細胞;活性氧及堿性單細胞凝膠電泳結果顯示,衰老間充質(zhì)干細胞對H2O2損傷更敏感,由H2O2引起的損傷應答能力降低,可能與氧化損傷應答基因的表達下調(diào)相關。3.生存曲線結果顯示博來霉素(BLM)作用下,年輕間充質(zhì)干細胞存活率明