骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響.pdf

1、背景及目的:
　　膿毒癥(sepsis)是宿主對(duì)感染的反應(yīng)失調(diào)而引起的危及生命的器官功能障礙，是由于感染引起的全身過(guò)度炎癥反應(yīng)、免疫失衡、內(nèi)皮損傷等因素致使細(xì)胞和組織受損，而產(chǎn)生多臟器功能不全的危重癥。其發(fā)病率高、住院費(fèi)用高、死亡率高，是一種全球性疾病負(fù)擔(dān)。
　　在膿毒癥的炎癥反應(yīng)、免疫失衡過(guò)程中巨噬細(xì)胞起關(guān)鍵作用，巨噬細(xì)胞的損傷與激活是機(jī)體發(fā)生失控性炎癥反應(yīng)的根本環(huán)節(jié)。巨噬細(xì)胞可分化為具有不同生物學(xué)特征的M1型和M2型兩類

2、。其中M1型巨噬細(xì)胞由干擾素γ(IFN-γ)和或脂多糖(LPS)誘導(dǎo)，表現(xiàn)為低表達(dá)甚至不表達(dá)白介素(IL)-10，并且分泌大量的促炎因子如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、IL-6、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)及趨化因子配體2（CCL-2），參與急性促炎反應(yīng)，清除入侵病原體和腫瘤細(xì)胞。M1表型巨噬細(xì)胞主要發(fā)揮針對(duì)病原微生物的炎癥反應(yīng)和發(fā)揮宿主的免疫防御功能，也會(huì)造成機(jī)體損傷。M2型巨噬細(xì)胞由IL-4或IL-13誘導(dǎo)，表現(xiàn)為IL-10高表達(dá)

3、，并分泌大量的抑炎因子如精氨酸酶1(Arg1)、甘露糖受體(CD206)、癥區(qū)分子1（FIZZ-1）、幾丁質(zhì)酶3樣分3(Ym1)，參與殺傷細(xì)胞外病原體、碎片清除、組織修復(fù)和傷口愈合。M2型巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗炎活性，對(duì)于修復(fù)和重塑炎癥后期由病原微生物造成的組織損傷以及重建組織穩(wěn)態(tài)中作用重大。
　　巨噬細(xì)胞的分化可以根據(jù)環(huán)境因素發(fā)生逆轉(zhuǎn)。接受不同的刺激，不僅能使尚未分型的成熟巨噬細(xì)胞發(fā)生分型極化，而且能使已分化的M1型和M2型巨噬

4、細(xì)胞之間可以相互轉(zhuǎn)化，能使激活的M1型轉(zhuǎn)化成M2型巨噬細(xì)胞，也能使M2型轉(zhuǎn)化成M1型巨噬細(xì)胞，這取決于M1型和M2型標(biāo)志蛋白表達(dá)量的可逆性轉(zhuǎn)化。M1型巨噬絀胞標(biāo)志蛋白包括表達(dá)CCL-2、IL-6和TNF-α等，而M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白有CD206、Arg-1、IL-10、Ym-1、FIZZ-1等。M1型巨噬細(xì)胞主要參與炎癥產(chǎn)生的起始和維持，M2型巨噬細(xì)胞主要參與炎癥控制，M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量的增加有利于炎癥的消除。巨噬細(xì)胞向何種表型極化決

5、定了炎癥的最終轉(zhuǎn)歸。
　　間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎作用和旁分泌特性，被廣泛用于免疫調(diào)節(jié)失衡導(dǎo)致的炎癥性相關(guān)疾病的治療。并且大量的研究主要圍繞在與T淋巴細(xì)胞的相互作用及免疫機(jī)制方面的探討。近年來(lái)有研究表明MSCs可改善內(nèi)毒素注射及盲腸結(jié)扎穿孔導(dǎo)致的膿毒癥動(dòng)物模型損傷。我們既往研究“骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)盲腸結(jié)扎穿孔所致膿毒痘動(dòng)物模型治療作用的研究”中也同樣發(fā)現(xiàn)膿毒癥動(dòng)物模型

6、TNF-α、IL-6和CCL-2mRNA表達(dá)水平增高，IL-10mRNA表達(dá)水平降低;血清中炎癥因子TNF-α、IL-6和CCL-2水平增高，抗炎因子IL-10水平降低，肺組織水腫，肺間質(zhì)血管擴(kuò)張、充血，肺泡間隔內(nèi)可見(jiàn)中性粒細(xì)胞，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，在小氣管、細(xì)支氣管周圍可見(jiàn)大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，肺組織炎癥損傷重。經(jīng)MSCs治療后TNF-α、IL-6和CCL-2mRNA表達(dá)水平降低，IL-10mRNA表達(dá)水平增高，血清中TNF-α、IL-6和CC

7、L-2水平下降，IL-10升高，肺組織結(jié)構(gòu)尚可，肺泡結(jié)構(gòu)無(wú)明顯破壞，小氣管、細(xì)支氣管周圍可見(jiàn)少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，肺組織的炎癥損傷明顯減輕，72h存活率明顯提高。提示MSCs對(duì)膿毒癥動(dòng)物模型有保護(hù)作用，并且可能是通過(guò)影響巨噬細(xì)胞起作用。
　　因此我們基于這些認(rèn)識(shí):1.膿毒癥中巨噬細(xì)胞起關(guān)鍵作用。巨噬細(xì)胞可以分化為M1/M2型巨噬細(xì)胞，M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白包括CCL-2、IL-6和TNF-α等，M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白有CD206、Ar

8、g-1、IL-10等。發(fā)生膿毒癥時(shí)M1型巨噬細(xì)胞分泌的炎癥因子TNF-α、IL-6水平升高，M2巨噬細(xì)胞分泌的抑炎因子IL-10等水平下降。2.巨噬細(xì)胞具有可塑性，接受不同的刺激不僅能使尚未分型的成熟巨噬細(xì)胞發(fā)生分型極化，而且已分化的M1型和M2型巨噬細(xì)胞之間可以相互轉(zhuǎn)化，能使激活的M1型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化成M2型巨噬細(xì)胞，也能使M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化成M1型巨噬細(xì)胞，這取決于M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白表達(dá)量的可逆性轉(zhuǎn)化。3.MSCs

9、對(duì)膿毒癥動(dòng)物模型有保護(hù)作用，可以降低全血中TNF-α、IL-6和CCL-2mRNA表達(dá)水平，同時(shí)也可以降低血清中促炎因子TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)水平，增加抗炎因子IL-10 mRNA表達(dá)水平，提高血清IL-10蛋白水平，此外，MSCs還可以減輕組織的炎癥反應(yīng)、保護(hù)臟器功能，從而提高動(dòng)物存活率。因此我們推測(cè)MSCs可能對(duì)巨噬細(xì)胞極化有影響，通過(guò)影響巨噬細(xì)胞的極化而抑制炎癥因子的表達(dá)水平、增加抗炎因子的表達(dá)水平，從而減輕組織的炎癥反應(yīng)，

10、保護(hù)臟器功能。
　　MSCs對(duì)巨噬細(xì)胞的作用的相關(guān)研究不多。有研究發(fā)現(xiàn)MSCs在體外與未極化巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后可使其具有M2型巨噬細(xì)胞的特點(diǎn)，M2型巨噬細(xì)胞比例上調(diào)，CD206表達(dá)上調(diào)，IL-10表達(dá)增加，TNF-α明顯降低，提示MSCs調(diào)控巨噬細(xì)胞表型向M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化，由組織促炎反應(yīng)向抗炎反應(yīng)調(diào)節(jié)，進(jìn)而改善失控性炎癥反應(yīng)。然而MSCs對(duì)已經(jīng)極化的巨噬細(xì)胞（M1/M2型巨噬細(xì)胞）是否有影響，是否可以促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞向M2型巨噬

11、細(xì)胞轉(zhuǎn)化，對(duì)M2型巨噬細(xì)胞是否有影響，這方面的相關(guān)研究尚未發(fā)現(xiàn)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)相比其他類型的干細(xì)胞在培養(yǎng)中更容易獲得并且能夠迅速增殖。鑒于此，本研究利用TranswellTM培養(yǎng)體系，探討B(tài)MSCs對(duì)M1/M2型巨噬細(xì)胞極化的影響。
　　方法:
　　第一部分 探索M1/M2型巨噬細(xì)胞極化體系:用不同劑量脂多糖(LPS)、干擾素γ（IFN-γ）刺激J774.1巨噬細(xì)胞24h誘導(dǎo)為M1型巨噬細(xì)胞;白細(xì)胞介素-4（

12、IL-4）刺激J774.1巨噬細(xì)胞24h誘導(dǎo)為M2型巨噬細(xì)胞。
　　第二部分
　　1.提取SPF級(jí)C57BL/6J小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)、鑒定BMSCs表面標(biāo)記物及成骨成脂誘導(dǎo)鑒定。
　　2.將已經(jīng)提取的BMSCs分別與M1/M2型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)24h后,收集巨噬細(xì)胞和上清液，用實(shí)時(shí)定量PCR和ELISA檢測(cè)巨噬細(xì)胞白細(xì)胞介素6（1L-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、趨化

13、因子配體2(CCL2)、CD86、精氨酸酶1(Arg1)、甘露糖受體/CD206（MR/CD206）、IL-10、炎癥區(qū)分子1(found in inflammatoryzone1，F(xiàn)IZZ1)、幾丁質(zhì)酶3樣分子3（chitinase3-like3，Ym-1）的變化。
　　結(jié)果：
　　第一部分
　　1.M1型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)極化的體系為100ng/mL LPS+30ng/mL IFN-γ，100ng/mL lL-4為M2型

14、巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)極化的最適體系。
　　2.M1型巨噬細(xì)胞細(xì)胞表面標(biāo)記為CD86，M2型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記為CD206。
　　3.M1型巨噬細(xì)胞表達(dá)的特異因子有IL-6、iNOS、TNF-α、CCL-2和CD86，M2型巨噬細(xì)胞特異表達(dá)的因子有Arg-1、CD206、FIZZ-1、Ym1和IL-10。
　　4.經(jīng)LPS和IFN-γ刺激誘導(dǎo)的M1型巨噬細(xì)胞形態(tài)為:巨噬細(xì)胞伸出偽足增多，呈樹(shù)突狀、梭狀及放射狀，表現(xiàn)為炎癥性巨噬細(xì)胞

15、形態(tài);而經(jīng)IL-4刺激誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞形態(tài)為:大部分巨噬細(xì)胞細(xì)胞體積略變大呈橢圓形，細(xì)胞黏附性增強(qiáng)，呈聚集或集落樣生長(zhǎng)，且胞質(zhì)豐富。
　　第二部分
　　1.第3代BMSCs貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)類似成纖維細(xì)胞，細(xì)胞表面標(biāo)記物流式鑒定，結(jié)果為CD44、CD90陽(yáng)性;CD45、CD34陰性，符合國(guó)際上對(duì)BMSCs的流式標(biāo)記物認(rèn)定標(biāo)準(zhǔn)。并且將第3代BMSCs成脂誘導(dǎo)3天后可見(jiàn)明顯增多的脂滴，7天時(shí)出現(xiàn)大量脂滴，油紅O染色成亮紅色。將第

16、3代BMSCs成骨誘導(dǎo)后細(xì)胞局部出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，誘導(dǎo)第7天細(xì)胞呈鋪路石狀匯集現(xiàn)象，堿性磷酸酶染色呈陽(yáng)性，誘導(dǎo)21天細(xì)胞周圍有鈣沉積，茜素紅染色，可見(jiàn)紅色鈣結(jié)節(jié)。表明培養(yǎng)的BMSCs分化能力很強(qiáng)。
　　2.BMSCs分別與M1/M2型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)棒狀、放射狀以及樹(shù)枝狀形態(tài)的巨噬細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞變圓，細(xì)胞黏附性增強(qiáng)，胞內(nèi)顆粒增多，且流式鑒定巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記CD86為陰性。
　　3.BMSCs使M1型巨噬細(xì)胞分泌的IL-6

17、、TNF-α、iNOS、CCL2、-CD86mRNA水平明顯減少，Arg1、CD206、IL-10 mRNA水平明顯增加，且上清液中IL-6和TNF-α含量明顯減少，CD206明顯增加。
　　4.BMSCs使M2型巨噬細(xì)胞分泌的Arg1、CD206、FIZZ-1、Ym-1、IL-10mRNA水平明顯增加，CD206明顯增加。
　　結(jié)論：
　　BMSCs不僅抑制M1型巨噬細(xì)胞活性，還能誘導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞極

18、化，使M2型巨噬細(xì)胞功能進(jìn)一步活化，抗炎因子生成增多，促炎因子生成減少，由組織促炎反應(yīng)向抗炎反應(yīng)調(diào)節(jié)，進(jìn)而改善失控性炎癥反應(yīng)。
　　意義:
　　本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了我們的設(shè)想:MSCs對(duì)巨噬細(xì)胞極化有影響，不僅對(duì)未極化巨噬細(xì)胞有影響，而且對(duì)已經(jīng)極化的巨噬細(xì)胞（M1/M2型巨噬細(xì)胞）有影響，通過(guò)影響巨噬細(xì)胞的極化而抑制炎癥因子的表達(dá)水平、增加抗炎因子的表達(dá)水平，從而減輕組織的炎癥反應(yīng)，保護(hù)臟器功能。本實(shí)驗(yàn)為研究BMSCs對(duì)膿毒癥等炎癥