鴨疫里默氏菌CH-1株wzxC基因功能研究.pdf

1、鴨疫里默氏菌（Riemerella anatipestifer，RA）病是危害養(yǎng)鴨業(yè)的主要傳染病之一，主要侵害2～7周齡的雛鴨，發(fā)病率和死亡率可達(dá)75％。臨床上主要表現(xiàn)為困倦、下痢、共濟(jì)失調(diào)，呈現(xiàn)典型的纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、干酪性輸卵管炎和腦膜炎。多糖(Polysaccharide，PS)屬于細(xì)菌的重要組成部分，其中莢膜多糖(Capsular Polysaccharide，CPS)對(duì)細(xì)菌抵抗外界環(huán)境壓力和毒力具有重要作用，但其

2、在鴨疫里默氏菌中的合成途徑我們并不清楚。Wzx是參與CPS的合成的寡聚糖翻轉(zhuǎn)酶，同時(shí)還參與了脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)的合成，但兩種合成途徑有所差別。生物信息分析表明鴨疫里默氏菌B739-1128基因編碼的蛋白WzxC可能參與莢膜多糖的合成，為近一步驗(yàn)證這項(xiàng)推測(cè)，我們進(jìn)行了以下研究。
　　首先，我們利用自殺性質(zhì)粒pYA4278和同源重組技術(shù)構(gòu)建了RA-CH-1△wzxC缺失株，并利用RT-PCR和熒光定

3、量PCR檢測(cè)突變株中wzxC下游基因B739-1129和wzxL基因，表明wzxC基因缺失不會(huì)引起B(yǎng)739-1129基因和wzxL基因的表達(dá)量發(fā)生變化。
　　隨后，對(duì)親本株和缺失株進(jìn)行了生物學(xué)特性比較分析，包括表型特點(diǎn)、莢膜染色、生化特性、生長曲線，發(fā)現(xiàn)wzxC基因缺失后會(huì)引起細(xì)菌的莢膜減少，生長穩(wěn)定期菌量降低;故隨后對(duì)菌株進(jìn)行了耐藥性、耐干燥性、耐氧化性、血清耐受性的檢測(cè)，以及對(duì)SPF雞胚的毒力和對(duì)Vero細(xì)胞的黏附入侵能力檢測(cè)

4、，結(jié)果表明，wzxC基因缺失后，細(xì)菌的耐干燥性下降了、耐氧化性、耐血清殺菌能力下降明顯，對(duì)SPF雞胚的ELD50下降4.38個(gè)數(shù)量級(jí)，而黏附入侵能力分別上調(diào)3.05個(gè)數(shù)量級(jí)和2.26個(gè)數(shù)量級(jí)，初步表明wzxC參與了CPS的合成，且CPS對(duì)RA的黏附入侵能力中起抑制作用。
　　最后，分別提取了RA-CH-1親本株RA-CH-1△wzxC缺失株的CPS和LPS，并進(jìn)行SDS-PAGE和銀染，濃硫酸-苯酚法測(cè)定CPS提取物中多糖的含量，

5、結(jié)果發(fā)現(xiàn)wzxC缺失后，LPS變化不明顯，而CPS則含量降低21.23％，且其中中、長鏈CPS條帶消失，表明wzxC與CPS合成相關(guān)，而與LPS合成相關(guān)性不明顯。
　　總之，本次實(shí)驗(yàn)從生物信息學(xué)分析的角度上和實(shí)驗(yàn)性方法上證明了鴨疫里默氏菌B739-1128編碼的WzxC蛋白參與了莢膜多糖的合成，這為研究鴨疫里默氏菌莢膜多糖和脂多糖的功能和合成途徑奠定了新的基礎(chǔ)，也為研究Wzx蛋白的功能及其功能特異性積累了素材。同時(shí)本次實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建