應(yīng)用重組蛋白P25檢測(cè)鴨疫里默氏菌抗體方法的研究.pdf

1、鴨疫里默氏菌(Riemerella anatipestfer，RA)是一種隸屬于黃桿菌科、無(wú)運(yùn)動(dòng)性、不形成芽孢的革蘭氏陰性菌，可引起鴨、火雞和其它多種鳥類的敗血性感染。目前已有多種類型的疫苗用于該病的控制，其中包括滅活苗、弱毒苗和亞單位疫苗等。而從實(shí)際應(yīng)用效果來(lái)看，現(xiàn)有的這些疫苗還存在著諸如免疫后抗體水平較低、免疫持續(xù)時(shí)間較短，免疫水平參差不齊等諸多缺點(diǎn)。另外，RA血清型復(fù)雜，國(guó)際公認(rèn)的血清型可多達(dá)21種，型間基本無(wú)交叉免疫保護(hù)，致使本

2、病的抗體監(jiān)測(cè)，免疫預(yù)防，診斷甚為困難。國(guó)內(nèi)已先后報(bào)道了檢測(cè)RA血清抗體的瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、玻板凝集試驗(yàn)以及ELISA等，但這些檢測(cè)方法存在檢測(cè)靈敏度低、重復(fù)性差、只能檢測(cè)個(gè)別血清型等缺點(diǎn)。 P25是以RA1的莢膜和外膜抗體從RA1的基因組文庫(kù)中篩選出的一種反應(yīng)性蛋白編碼基因的ORF全長(zhǎng)687 bp，其編碼229個(gè)氨基酸。BLAST分析表明其與GenBank中收錄的AF104 936序列中第1 402～2 088區(qū)域核苷酸序列完全一致

3、。以RA1型P25基因設(shè)計(jì)特異性引物，從1、2、5、8、10等血清型RA中可克隆獲得高度相似的ORF序列，編碼產(chǎn)物氨基酸序列具有高度同一性。利用在線工具分析了不同血清型P25抗原的潛在抗原區(qū)；5種不同血清的抗原區(qū)，抗原表位均具有相同的數(shù)量。抗原表位基序的Logo分析顯示，盡管在不同血清型間具有個(gè)別氨基酸(Amino acid，AA)的變異，但未見(jiàn)可能導(dǎo)致抗原決定簇變化的AA(Cys，Leu，Val)出現(xiàn)變異，表明RA的P25與其它細(xì)菌外

4、膜蛋白一樣，其是不同血清型RA間所共同表達(dá)的保護(hù)性抗原，可用作不同RA血清型感染的診斷抗原。 應(yīng)用常規(guī)的分子生物學(xué)方法重組表達(dá)菌Escherichia coli Rosetta(pET-32a(+)-P25)在0.1 mmol/L IPTG的誘導(dǎo)下達(dá)到可溶性的表達(dá)，蛋白通過(guò)Ni-NTA純化試劑盒得到高度純化，純化效率達(dá)90％以上；完全達(dá)到建立ELISA和其它診斷所用抗原的要求。重組表達(dá)產(chǎn)物的交叉Western blot分析和不同

5、血清型間ELISA檢測(cè)結(jié)果分析，表明P25是各種血清型RA間所共有的一種抗原。 以P25基因的重組表達(dá)產(chǎn)物為包被抗原，建立了檢測(cè)鴨疫里默氏菌血清抗體的間接ELISA。建立的ELISA方法經(jīng)十字交叉滴定試驗(yàn)其最適抗原包被濃度為0.6μg/mL，血清最佳稀釋度為1:64；該試驗(yàn)特異性強(qiáng)，與鴨源大腸埃希菌、鴨源多殺性巴氏桿菌感染鴨血清無(wú)交叉反應(yīng)。 20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的膠體金免疫層析技術(shù)(gold immunochroma