應(yīng)用重組蛋白P25檢測鴨疫里默氏菌抗體方法的研究.pdf

1、鴨疫里默氏菌(Riemerella anatipestfer，RA)是一種隸屬于黃桿菌科、無運動性、不形成芽孢的革蘭氏陰性菌，可引起鴨、火雞和其它多種鳥類的敗血性感染。目前已有多種類型的疫苗用于該病的控制，其中包括滅活苗、弱毒苗和亞單位疫苗等。而從實際應(yīng)用效果來看，現(xiàn)有的這些疫苗還存在著諸如免疫后抗體水平較低、免疫持續(xù)時間較短，免疫水平參差不齊等諸多缺點。另外，RA血清型復(fù)雜，國際公認的血清型可多達21種，型間基本無交叉免疫保護，致使本

2、病的抗體監(jiān)測，免疫預(yù)防，診斷甚為困難。國內(nèi)已先后報道了檢測RA血清抗體的瓊脂擴散試驗、玻板凝集試驗以及ELISA等，但這些檢測方法存在檢測靈敏度低、重復(fù)性差、只能檢測個別血清型等缺點。 P25是以RA1的莢膜和外膜抗體從RA1的基因組文庫中篩選出的一種反應(yīng)性蛋白編碼基因的ORF全長687 bp，其編碼229個氨基酸。BLAST分析表明其與GenBank中收錄的AF104 936序列中第1 402～2 088區(qū)域核苷酸序列完全一致

3、。以RA1型P25基因設(shè)計特異性引物，從1、2、5、8、10等血清型RA中可克隆獲得高度相似的ORF序列，編碼產(chǎn)物氨基酸序列具有高度同一性。利用在線工具分析了不同血清型P25抗原的潛在抗原區(qū)；5種不同血清的抗原區(qū)，抗原表位均具有相同的數(shù)量?？乖砦换虻腖ogo分析顯示，盡管在不同血清型間具有個別氨基酸(Amino acid，AA)的變異，但未見可能導(dǎo)致抗原決定簇變化的AA(Cys，Leu，Val)出現(xiàn)變異，表明RA的P25與其它細菌外

4、膜蛋白一樣，其是不同血清型RA間所共同表達的保護性抗原，可用作不同RA血清型感染的診斷抗原。 應(yīng)用常規(guī)的分子生物學(xué)方法重組表達菌Escherichia coli Rosetta(pET-32a(+)-P25)在0.1 mmol/L IPTG的誘導(dǎo)下達到可溶性的表達，蛋白通過Ni-NTA純化試劑盒得到高度純化，純化效率達90％以上；完全達到建立ELISA和其它診斷所用抗原的要求。重組表達產(chǎn)物的交叉Western blot分析和不同

5、血清型間ELISA檢測結(jié)果分析，表明P25是各種血清型RA間所共有的一種抗原。 以P25基因的重組表達產(chǎn)物為包被抗原，建立了檢測鴨疫里默氏菌血清抗體的間接ELISA。建立的ELISA方法經(jīng)十字交叉滴定試驗其最適抗原包被濃度為0.6μg/mL，血清最佳稀釋度為1:64；該試驗特異性強，與鴨源大腸埃希菌、鴨源多殺性巴氏桿菌感染鴨血清無交叉反應(yīng)。 20世紀80年代發(fā)展起來的膠體金免疫層析技術(shù)(gold immunochroma