鴨疫里默氏桿菌致病相關(guān)因子研究.pdf

1、鴨疫里默氏桿菌是一個(gè)多宿主的病原菌，除主要引起家鴨的滲出性炎癥以外，還感染鵝、雞、火雞、鴿子、野鴨、鸚鵡等其它鳥類，甚至已從豬、青魚體內(nèi)分離鑒定出該細(xì)菌。目前鴨疫里默氏桿菌已成為危害養(yǎng)鴨業(yè)的主要病原之一，呈世界性流行趨勢(shì)，發(fā)病率和死亡率一般為10-30％，但部分鴨場(chǎng)達(dá)95％以上。該細(xì)菌的危害除引起動(dòng)物發(fā)病、死亡外，還因感染耐過動(dòng)物飼料轉(zhuǎn)化率低、生長(zhǎng)發(fā)育遲緩造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，甚至由于抗菌藥物的大量使用而引起食品安全問題。自1982年以來

2、，尤其是在東亞和東南亞地區(qū)，鴨疫里默氏桿菌感染嚴(yán)重制約了肉鴨的集約化養(yǎng)殖。 鴨疫里默氏桿菌血清型復(fù)雜，各血清型菌株間缺乏交叉免疫保護(hù)：極易產(chǎn)生耐藥性，流行菌株多表現(xiàn)為多重耐藥。關(guān)于其致病相關(guān)因子尚不明確，而對(duì)于致病機(jī)制的研究處于起步階段。作者在研究鴨疫里默氏桿菌液化明膠菌株的流行病學(xué)特征的過程中發(fā)現(xiàn)，鴨疫里默氏桿菌液化明膠特性與致病性有關(guān)?；诖?，本文以液化明膠活性成分（明膠酶）為對(duì)象，研究鴨疫里默氏桿菌的致病相關(guān)因子，為進(jìn)一步

3、研究細(xì)菌的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 1．鴨疫里默氏桿菌流行菌株的分離鑒定及液化明膠特性測(cè)定 利用巧克力營養(yǎng)瓊脂平板從2004-2008年收集于重慶、四川等25個(gè)地區(qū)的661份疑似鴨疫里默氏桿菌感染的自然病例中分離、鑒定出548株鴨疫里默氏桿菌，其中512株對(duì)10日齡鴨具有毒力，25株細(xì)菌經(jīng)鴨體內(nèi)傳1-3代后獲得毒力，11株在鴨體內(nèi)傳7代仍不具有毒力。利用明膠-營養(yǎng)瓊脂平板和明膠-瓊脂平板分別測(cè)定細(xì)菌及培養(yǎng)濾液的液化明膠特性，有

4、毒力的537株細(xì)菌及培養(yǎng)濾液都能液化明膠，占分離菌株的98％；不具有毒力的11株細(xì)菌及培養(yǎng)濾液不能液化明膠，占分離菌株的2％。鴨疫里默氏桿菌液化明膠特性穩(wěn)定，液化明膠和不液化明膠菌株在巧克力培養(yǎng)基和鴨體內(nèi)分別傳30和10代后未發(fā)現(xiàn)明顯的變化。液化明膠的鴨疫里默氏桿菌培養(yǎng)濾液的明膠酶譜呈現(xiàn)6條活性帶，不同菌株各譜帶的活性存在差異，且各譜帶活性能被EDTA抑制。 2．鴨疫里默氏桿菌產(chǎn)明膠酶的條件優(yōu)化及酶的分離純化 本研究在建

5、立定量測(cè)定鴨疫里默氏桿菌明膠酶活性的基礎(chǔ)上，對(duì)鴨疫里默氏桿菌產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化。研究結(jié)果表明，產(chǎn)酶培養(yǎng)基的基本組成為2％蛋白胨、0．5％酵母粉和0．5％氯化鈉，初始pH值為7．4；培養(yǎng)基含終濃度5mMCa2+有利于酶的產(chǎn)生；最適培養(yǎng)溫度為37℃，在振蕩條件下的最適培養(yǎng)時(shí)間為24h。 在最佳條件下培養(yǎng)AF株細(xì)菌，培養(yǎng)濾液經(jīng)分子截流量為10kDa超濾膜濃縮、最終飽和度為70％硫酸銨鹽析、DEAE-Sepharose Fast Flo

6、w陰離子交換層析、phenyl-sepharose CL-4B疏水柱層析及Superdex-75凝膠柱層析分離純化，獲得具有液化明膠活性的蛋白質(zhì)組分（明膠酶），活性回收率為28．4％。分離純化的明膠酶的比活力為17076．0U/mg：經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)為分子量59kDa單帶；明膠酶譜與培養(yǎng)濾液的第5活性條帶一致。 3．鴨疫里默氏桿菌明膠酶的生物學(xué)活性研究 本研究利用鴨胚成纖維細(xì)胞和10日齡雛鴨模型對(duì)分離純化的鴨疫里默

7、氏桿菌明膠酶的生物學(xué)活性進(jìn)行了研究。明膠酶對(duì)鴨胚成纖維細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，半數(shù)致死濃度（LG50）和半數(shù)生長(zhǎng)抑制濃度（GI50）分別為1．45U/ml和0．16U/ml；導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)發(fā)生異常，主要表現(xiàn)為細(xì)胞膜降解、細(xì)胞質(zhì)喪失與細(xì)胞核濃縮。對(duì)30株鴨疫里默氏桿菌臨床分離株的培養(yǎng)濾液檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，具有毒力及能液化明膠的27株細(xì)菌均能引起與明膠酶一致的細(xì)胞形態(tài)變化，而無毒力及不液化明膠的3株細(xì)菌的培養(yǎng)濾液不表現(xiàn)細(xì)胞毒性。 明膠酶對(duì)雛鴨具有毒

8、性，能增強(qiáng)鴨疫里默氏桿菌對(duì)動(dòng)物的侵襲力，增加菌血癥的嚴(yán)重程度，縮短感染潛伏期和致死動(dòng)物的時(shí)間，顯著提高動(dòng)物的死亡率。頸靜脈注射5000U/ml能致死10日齡雛鴨，2000U/ml能引起發(fā)病，而500U/ml的作用不明顯。發(fā)病動(dòng)物主要表現(xiàn)嗜睡懶動(dòng)、腿軟無力、甩頭、張口呼吸及頭頸歪斜等癥狀；死亡動(dòng)物有肝臟輕微腫大、硬腦膜有出血點(diǎn)、大腦水腫等大體病理變化。在組織學(xué)上，2000U/ml作用8h鴨的心肌纖維腫脹變粗、橫紋不明顯，纖維間質(zhì)水腫、可見

9、微細(xì)顆粒和空泡；肝細(xì)胞索不規(guī)則，肝血竇變小，肝細(xì)胞腫脹、胞漿中出現(xiàn)大小不等的空泡；脾中央動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、脫落，脾小體局灶性出血及小淋巴管擴(kuò)張，淋巴鞘數(shù)量增多、管徑擴(kuò)大，淋巴細(xì)胞不同程度變性、壞死。在超微結(jié)構(gòu)上，心肌細(xì)胞線粒體腫大，毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞中多空泡、核膜不均一；肝細(xì)胞核濃縮、邊緣有皺褶，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞間連接不緊密、紅細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則；脾淋巴細(xì)胞核膜不規(guī)則、染色質(zhì)核周邊濃集。 明膠酶經(jīng)靜脈注射后對(duì)雛鴨外周血血液指標(biāo)的影響

10、明顯。雛鴨外周血中紅細(xì)胞（RBC）的數(shù)量與C3b花環(huán)率顯著下降，在9h最低，分別為（1．58±0．05）×1012·L-1和（18．5±1．32）％。白細(xì)胞（WBC）的數(shù)量減少；對(duì)綿羊紅細(xì)胞的吞噬率（BP）與吞噬指數(shù)（IP）降低，在6h時(shí)最低，分別為（27．7±2．0）％和1．053±0．015，與對(duì)照差異極顯著；對(duì)金黃色葡萄球菌的殺菌指數(shù)下降，在9h時(shí)最低為0．4562±0．0205，與對(duì)照差異極顯著。外周血中淋巴細(xì)胞（LT）數(shù)量減少

11、；a-醋酸萘酯酶陽性T淋巴細(xì)胞百分率降低。血清谷草/谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性、堿性磷酸酶活性及總膽固醇和血清葡萄糖水平顯著升高。血清總補(bǔ)體活性（CH50）顯著下降。 明膠酶的作用對(duì)雛鴨脾臟損傷嚴(yán)重，導(dǎo)致脾淋巴細(xì)胞的增殖活性和生成IgG的能力下降，9h最低，分別為0．185±0．022和0．237±0．038，與對(duì)照差異極顯著；可引起雛鴨血．腦屏障機(jī)能障礙，表現(xiàn)為腦脊液中的白蛋白含量升高，血-腦屏障的通透性增大，基底膜粗糙、部分節(jié)段的連續(xù)性

12、中斷，腦血管周圍水腫、管腔面不光滑、內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、連接處開放。 4．鴨疫里默氏桿菌明膠酶基因克隆及分析 從AF株培養(yǎng)濾液中分離純化的明膠酶N-氨基酸殘基序列為：天冬酰胺-蘇氨酸-甘氨酸-丙氨酸-丙氨酸-谷氨酸-甘氨酸-蘇氨酸-組氨酸-甘氨酸（NTGAAEGTHG），在NCBI中未能找到同源序列，僅第3-10位氨基酸殘基與類鼻疽伯克霍爾德菌406e株的一個(gè)假設(shè)保守蛋白的第555-562一致。在此基礎(chǔ)上，以N端氨基酸序列設(shè)計(jì)

13、引物，用單特性引物PCR（SSP-PCR）從細(xì)菌基因組DNA文庫中克隆出197bp的DNA片段，然后利用熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR（Tail-PCR）進(jìn)行基因組步移，獲得2150bp核苷酸序列。該序列中有一個(gè)1872bp的ORF，編碼624aa，其中包含NTGAAEGTHG序列；1-24aa為信號(hào)肽；成熟蛋白存在3個(gè)跨膜區(qū)，分別在25-45aa、211-232aa和416-435aa；在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中未能找到同源性序列。 5．鴨疫里默氏

14、桿菌明膠酶的理化特性測(cè)定 鴨疫里默氏桿菌明膠酶不降解Ⅰ型膠原蛋白維、干酪素、牛血清白蛋白Ⅴ及Azocoll試劑；降解明膠的最適作用溫度和pH值分別為37℃和7．8，在4℃24h及37℃2h內(nèi)穩(wěn)定、65℃0．1h內(nèi)完全失活；Ca2+、Mg2+、Na+和Zn2+對(duì)酶有一定激活作用，Cu2+、Cd2+、Mn2+、Hg2+及金屬離子絡(luò)合物EDTA和EGTA對(duì)酶活性有強(qiáng)烈的抑制作用，但絡(luò)合物的抑制作用可以被Ca2+逆轉(zhuǎn)：蛋白質(zhì)化學(xué)修飾劑2