鴨疫里默氏桿菌檢測(cè)方法的建立.pdf

1、鴨疫里默氏菌(Riemerella anatipestiler，RA)病是一種主要侵害鴨、火雞和其他鳥(niǎo)類的接觸性傳染病，該病又稱為新鴨病、鴨疫綜合征、傳染性漿膜炎和鴨疫巴氏桿菌病等。該病主要病理變化是纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、腦膜炎、干酪樣輸卵管炎等，發(fā)病率高，病死率也高。耐過(guò)鴨多成僵鴨，生長(zhǎng)遲緩，造成極大的經(jīng)濟(jì)損失，是目前危害養(yǎng)鴨業(yè)的主要傳染病之一。目前該病在檢測(cè)上主要通過(guò)通過(guò)流行病學(xué)調(diào)查、臨床癥狀、病理變化、細(xì)菌的分離鑒定、分

2、子生物學(xué)檢測(cè)及血清學(xué)檢測(cè)。這些方法能夠較為準(zhǔn)確的檢測(cè)出該病。 本實(shí)驗(yàn)主要建立了該菌的PCR檢測(cè)方法和該病的間接ELISA檢測(cè)方法，能夠快速、準(zhǔn)確鑒定。 本研究成功的建立了該菌的PCR檢測(cè)方法。根據(jù)Genbank公布的鴨疫里默氏桿菌OmpA基因中ATCC株OmpA序列，應(yīng)用DNAstar引物設(shè)計(jì)軟件，在基因保守區(qū)設(shè)計(jì)了特異性引物，初步建立一種快速、經(jīng)濟(jì)、敏感的菌落PCR檢測(cè)方法，以直接鑒定該菌。經(jīng)分離鑒定1、2、10、11

3、型16株菌，均擴(kuò)增出670bp的特異性片段，表明該引物的可靠性。特異性試驗(yàn)結(jié)果表明，1、2、10、11型4參考菌株均能擴(kuò)增出670bp特異性的核酸片段，而大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，PCR的最低檢出限量為80個(gè)鴨疫里氏桿菌。對(duì)新建立的菌落PCR及常規(guī)PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增比較，結(jié)果表明菌落PCR和常規(guī)PCR的結(jié)果一致，均能擴(kuò)增出相同大小的特異性條帶，進(jìn)一步證明了菌落PCR技術(shù)檢測(cè)該菌的可靠性。 本

4、研究成功的克隆表達(dá)了參照已知鴨疫里默氏桿菌外膜蛋白A(OmpA)全基因序列設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到目的片段約l 164bp，然后克隆入pET-28a(+)載體中，經(jīng)測(cè)序比較，與標(biāo)準(zhǔn)序列的核苷酸同源性達(dá)98.5％。轉(zhuǎn)化BL21-DL3，經(jīng)誘導(dǎo)后，SDS-PAGE結(jié)果顯示，OmpA得到高效表達(dá)，Western-blotting檢測(cè)呈陽(yáng)性，可被RA1型和RA2型全菌兔血清識(shí)別。該研究為鴨疫里默氏桿菌的免疫檢測(cè)提供了新的方法。