鴨疫里默氏桿菌檢測方法的建立.pdf

1、鴨疫里默氏菌(Riemerella anatipestiler，RA)病是一種主要侵害鴨、火雞和其他鳥類的接觸性傳染病，該病又稱為新鴨病、鴨疫綜合征、傳染性漿膜炎和鴨疫巴氏桿菌病等。該病主要病理變化是纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、腦膜炎、干酪樣輸卵管炎等，發(fā)病率高，病死率也高。耐過鴨多成僵鴨，生長遲緩，造成極大的經濟損失，是目前危害養(yǎng)鴨業(yè)的主要傳染病之一。目前該病在檢測上主要通過通過流行病學調查、臨床癥狀、病理變化、細菌的分離鑒定、分

2、子生物學檢測及血清學檢測。這些方法能夠較為準確的檢測出該病。 本實驗主要建立了該菌的PCR檢測方法和該病的間接ELISA檢測方法，能夠快速、準確鑒定。 本研究成功的建立了該菌的PCR檢測方法。根據Genbank公布的鴨疫里默氏桿菌OmpA基因中ATCC株OmpA序列，應用DNAstar引物設計軟件，在基因保守區(qū)設計了特異性引物，初步建立一種快速、經濟、敏感的菌落PCR檢測方法，以直接鑒定該菌。經分離鑒定1、2、10、11

3、型16株菌，均擴增出670bp的特異性片段，表明該引物的可靠性。特異性試驗結果表明，1、2、10、11型4參考菌株均能擴增出670bp特異性的核酸片段，而大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌的擴增結果均為陰性。敏感性試驗結果表明，PCR的最低檢出限量為80個鴨疫里氏桿菌。對新建立的菌落PCR及常規(guī)PCR方法進行擴增比較，結果表明菌落PCR和常規(guī)PCR的結果一致，均能擴增出相同大小的特異性條帶，進一步證明了菌落PCR技術檢測該菌的可靠性。 本

4、研究成功的克隆表達了參照已知鴨疫里默氏桿菌外膜蛋白A(OmpA)全基因序列設計1對特異性引物，經PCR擴增得到目的片段約l 164bp，然后克隆入pET-28a(+)載體中，經測序比較，與標準序列的核苷酸同源性達98.5％。轉化BL21-DL3，經誘導后，SDS-PAGE結果顯示，OmpA得到高效表達，Western-blotting檢測呈陽性，可被RA1型和RA2型全菌兔血清識別。該研究為鴨疫里默氏桿菌的免疫檢測提供了新的方法。