鴨疫里默氏桿菌phoP基因鑒定及其突變株的免疫效果評(píng)價(jià).pdf

1、鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer，RA）是影響我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)最為嚴(yán)重的疾病病原之一，該病在養(yǎng)殖地區(qū)分布廣泛，感染主要引起心包炎、肝周炎和氣囊炎等，造成雛鴨生長(zhǎng)緩慢、大批死亡嚴(yán)重制約著我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)發(fā)展。RA有21種血清型且不同血清型間交叉保護(hù)效果不好，目前市售疫苗存在一些缺陷如應(yīng)用比較廣泛的油乳劑滅活苗無(wú)法提供完全保護(hù)（70％左右的保護(hù)率）且存在注射吸收不理想，毒株覆蓋不完全等問(wèn)題。
　　我們利用基因工程技

2、術(shù)制備RA-CH1基因缺失活疫苗，旨在尋找一種能有效對(duì)RA進(jìn)行有效減毒的疫苗株用于對(duì)該疾病的預(yù)防。本研究首先通過(guò)序列對(duì)比設(shè)計(jì)引物克隆了RA-CH1潛在的phoP基因。然后為了驗(yàn)證克隆基因的正確性，我們將擴(kuò)增基因片段連接到低拷貝的pYA3337質(zhì)粒上，再將重組質(zhì)粒導(dǎo)入沙門氏菌ΔphoP基因缺失株中進(jìn)行功能鑒定。結(jié)果表明，RA-CH1潛在的phoP基因能夠回補(bǔ)沙門菌phoP基因的功能。同時(shí)，生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示克隆的phoP基因編碼的Ph

3、oP蛋白沒(méi)有信號(hào)肽位點(diǎn)和跨膜區(qū)。接著，我們對(duì)RA-CH1 phoP基因進(jìn)行了原核表達(dá)及多克隆抗體制備，PCR擴(kuò)增phoP基因連接至表達(dá)載體pET32a后轉(zhuǎn)入Rosetta表達(dá)菌中。按照蛋白表達(dá)流程對(duì)其進(jìn)行表達(dá)并優(yōu)化表達(dá)條件，將表達(dá)蛋白進(jìn)行純化后免疫兔子制備多克隆抗體，瓊擴(kuò)試驗(yàn)測(cè)定多次免疫后兔子免疫抗血清效價(jià)比達(dá)到1∶16，這為后續(xù)研究細(xì)菌中phoP調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及與蛋白間相互作用奠定了基礎(chǔ)。
　　我們還通過(guò)pRE112自殺質(zhì)粒介導(dǎo)的同源

4、重組構(gòu)建RA-CH1ΔphoP基因缺失株，并對(duì)其生物學(xué)特性、免疫原性和免疫保護(hù)效應(yīng)進(jìn)行了系統(tǒng)性的研究。根據(jù)RA phoP上下游序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)交疊PCR融合phoP基因同源臂并在插入Spec抗性基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒pRE112-Left-Spec-Right，通過(guò)細(xì)菌結(jié)合法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入RA-CH1中，用卡那霉素和壯觀霉素雙抗篩選得到RA-CH1ΔphoP基因缺失株，對(duì)RA-CH1ΔphoP進(jìn)行生物學(xué)特性研究:生長(zhǎng)曲線測(cè)定表明該突變株生

5、長(zhǎng)略慢于野生株;藥敏試驗(yàn)表明缺失株對(duì)氨芐西林敏感性下降，對(duì)慶大霉素敏感性上升;測(cè)定缺失株對(duì)鴨胚成纖維粘附力與侵襲力能力發(fā)現(xiàn)與親本株無(wú)明顯差異;檢測(cè)組織載量發(fā)現(xiàn)突變株接種后12h肝臟和24h大腦中組織載量顯著低于野生株;另外，毒力試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)基因缺失株毒力減近100倍。最后，我們?cè)u(píng)估了RA-CH1ΔphoP基因缺失株的免疫原性及免疫保護(hù)效果，將疫苗株經(jīng)腿部肌肉注射接種雛鴨，三周后用約150×LD50劑量同源株攻毒并記錄一個(gè)月內(nèi)雛鴨的生長(zhǎng)情況。