鴨疫里默氏菌GroEL和GroES蛋白生物活性及不同應(yīng)激條件對其表達(dá)量的影響.pdf

1、熱休克蛋白GroEL蛋白和其輔助伴侶蛋白GroES蛋白作為熱休克蛋白家族中的重要成員，在細(xì)菌抵抗外界不良環(huán)境時(shí)發(fā)揮著重要作用。本文對鴨疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer，RA)的GroEL蛋白和其輔助因子GroES蛋白基因進(jìn)行了克隆、表達(dá)和純化，檢測了GroEL和GroES蛋白的生物活性以及不同應(yīng)激條件對其表達(dá)水平的影響。研究結(jié)果如下:
　　1.GroEL和GroES基因的原核表達(dá)及GroEL-GroES

2、融合表達(dá)
　　以RA CH-1株基因組為模板，通過PCR擴(kuò)增出GroEL和GroES基因片段，并克隆到pMD19-T載體上。利用原核表達(dá)系統(tǒng)pET-28a(+)表達(dá)重組蛋白GroEL和GroES，采用親和層析法純化得到GroEL和GroES重組蛋白。經(jīng)過SDS-PAGE分析兩種蛋白的分子量約為65 kDa和15 kDa。通過分別擴(kuò)增RA GroEL和GroES基因，然后運(yùn)用重疊PCR將GroEL和GroES基因通過Linker連接

3、構(gòu)建得到融合基因GroEL-GroES，將其定向克隆到pMD19-T載體上。再將GroEL-GroES目的基因定向插入pET-28a(+)原核表達(dá)系統(tǒng)，通過SDS-PAGE分析，融合表達(dá)的GroEL-GroES蛋白分子量約為70kD。
　　2.GroEL和GroES蛋白同源模建與分析及活性研究
　　基于同源模建軟件Modeller預(yù)測了GroEL和GroES蛋白的三維結(jié)構(gòu)，所預(yù)測的蛋白結(jié)構(gòu)合理性采用Procheck軟件進(jìn)行評

4、估。結(jié)果顯示GroEL和GroES蛋白模建后的結(jié)構(gòu)均能與模板能很好的疊合。用Autodock4.0軟件將GroEL結(jié)構(gòu)模型與ATP進(jìn)行自動(dòng)對接，分析二者之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)ATP的嘌呤環(huán)能夠伸入GroEL蛋白由氨基酸殘基ALA-2、LEU-524和PRO-525所組成的疏水性腔袋，同時(shí)ATP三磷酸基團(tuán)分別與氨基酸殘基ASP-4和ILE-5形成氫鍵，GroEL可與ATP形成穩(wěn)定的復(fù)合物。
　　本試驗(yàn)分別測定了GroEL和GroEL-

5、GroES蛋白在15-70℃的ATP酶活性，發(fā)現(xiàn)GroEL和GroEL-GroES蛋白在55℃左右時(shí)酶活性最高，且活性隨溫度變化而變化，但GroEL和GroEL-GroES蛋白的酶活性無顯著性差異。GroES在30-55℃時(shí)能夠提高GroEL的ATP酶活性，但在55℃后對GroEL的ATP酶活性無明顯影響。
　　3.不同應(yīng)激條件對GroEL和GroES基因表達(dá)量的影響
　　通過RT-qPCR技術(shù)，對不同應(yīng)激環(huán)境條件下RA C

6、H-1株GroEL和GroES基因表達(dá)量變化進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，在不同熱激溫度下，GroEL和GroES基因表達(dá)量隨熱激溫度的升高而升高。在55℃熱激時(shí)，GroEL和GroES基因的表達(dá)量達(dá)到最高，GroEL和GroES基因分別上調(diào)了3.59倍和3.62倍，差異顯著(P＜0.05)。
　　在低濃度H2O2濃度（1.25％和2.5％）條件下，GroEL基因表達(dá)量明顯上調(diào)，其表達(dá)量分別為對照組的2.45倍和2.22倍（P＜0.05）。

7、GroES基因僅在1.25％濃度條件下，相對表達(dá)量明顯升高，其表達(dá)量為對照組的2.62倍(P＜0.05)，但在2.5％濃度條件下，表達(dá)量下調(diào)，差異不顯著(P＞0.05)。在高濃度H2O2(5％)作用下，GroEL和GroES基因表達(dá)量均受到抑制（P＞0.05）。
　　不同pH對RA作用10min后均引起GroEL和GroES基因mRNA的表達(dá)水平的變化。在酸性條件(pH=3)下，GroEL和GroES基因mRNA的表達(dá)量，分別為對

8、照組(pH=7)的2.105倍和4.683倍(P＜0.05)。在堿性條件(pH=10)，GroEL和GroES基因mRNA的表達(dá)量分別上調(diào)了4.8％和51.3％，但與對照組相比，差異不顯著(P＞0.05)。結(jié)果表明，酸性環(huán)境顯著影響GroEL和GroES基因的表達(dá)量，而堿性環(huán)境對GroEL和GroES基因的表達(dá)量無明顯影響。
　　在低鹽濃度(3％)條件下，與普通TSB培養(yǎng)基比較，GroEL和GroES基因在含有3％ NaCl TS