靈芝多糖對H22荷瘤小鼠腸道黏膜免疫功能的影響.pdf

1、中醫(yī)理論認(rèn)為正氣內(nèi)虛是腫瘤發(fā)生的重要基礎(chǔ),因此扶正培本是腫瘤治療的重要法則,由于扶正培本藥物亦可明顯減輕化療引起的毒副反應(yīng),因而被廣泛應(yīng)用于腫瘤及腫瘤化療后的治療。靈芝具有養(yǎng)心安神、補氣益血、補肺平喘、滋補強壯、扶正培本、延年益壽等功效?，F(xiàn)代研究表明,靈芝具有多種生物活性成分,而研究最早、最為深入、功能也最為復(fù)雜的是靈芝多糖(Ganoderma Lucidum Polysaccharides,GLP)。GLP具有明顯的抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)作

2、用,因此被認(rèn)為是靈芝扶正培本的主要成份。研究表明GLP分子中能夠產(chǎn)生上述生理活性的結(jié)構(gòu)是含β-(1,3)鍵的葡聚糖,然而從現(xiàn)有的研究報道可知,機體是很難在胃腸道內(nèi)酶解含β-(1,3)鍵的多糖,也即是說口服GLP將難以被機體消化,但長期臨床和動物實驗均證明口服GLP具有明顯的免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤作用。因此我們推測GLP可能通過調(diào)節(jié)腸道黏膜免疫功能而激發(fā)機體的免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤作用。據(jù)此,本課題在中醫(yī)理論的指導(dǎo)下,應(yīng)用流式細胞術(shù)(Flow Cyt

3、ometry,FCM)、免疫組化(Immunohistochemistry,IHC)、酶聯(lián)免疫(Enzyme LinkedImmunosorbent Assay,ELISA)、酶聯(lián)免疫斑點(Enzyme-Linked Immunospot Assay,ELISPOT)及逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse Transcription-Polymerase ChainReaction,RT-PCR)等技術(shù),從整體、細胞、分子水平,首次將

4、GLP對荷瘤機體腸道黏膜免疫功能的影響進行了深入的研究。通過體內(nèi)實驗與體外實驗兩方面進行研究與探討,結(jié)果表明:
　　 一 GLP對體外培養(yǎng)的H22細胞具有明顯的抑制作用,且能促進腸道黏膜淋巴細胞的增殖與分泌
　　 1采用MTT法觀察GLP對體外培養(yǎng)H22細胞生長的影響,發(fā)現(xiàn)GLP對H22細胞具有直接的殺傷作用,且與藥物濃度及作用時間成正相關(guān),隨著藥物濃度的增加、作用時間的延長,細胞毒作用明顯增強。加藥72h后,500μg

5、/ml GLP對H22細胞的抑制率為47.97％。
　　 2通過ELISPOT方法檢測GLP對外周血單個核細胞(PBMC)及PP結(jié)淋巴細胞(PPL)分泌細胞因子的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)各濃度GLP均能刺激PBMC分泌IL-2,但是對PPL卻沒有直接的刺激作用。采用MTT法發(fā)現(xiàn)在ConA協(xié)同作用下,GLP不僅能刺激PBMC增殖,且能刺激上皮內(nèi)淋巴細胞(IEL)與PPL增殖,通過ELISA法檢測其上清,顯示GLP均能明顯增加PBMC、IEL

6、、PPL對IL-2與IL-10的分泌,RT-PCR結(jié)果也顯示TNF-α與IL-10 mRNA的表達相應(yīng)增加,并發(fā)現(xiàn)GLP在62.5μg/ml、125μg/ml時,淋巴細胞對IL-2、IL—10與TNF-α基因及蛋白的表達最強,但不具有劑量依賴性。
　　 二體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)GLP能調(diào)節(jié)H22荷瘤小鼠腸道黏膜免疫功能
　　 1本研究結(jié)果顯示,環(huán)磷酰胺(CTX)、GLP、CTX+GLP均能顯著抑制腫瘤的生長,抑瘤率分別為78.12

7、％、38.64％、78.53％。通過對體重的觀察發(fā)現(xiàn),模型組與正常組相比,無顯著差異；CTX組、CTX+GLP組與模型組比較,體重明顯降低,但CTX組與CTX+GLP組相比較無顯著性差異。可見在此荷瘤小鼠模型中,GLP未顯示出對CTX的協(xié)同增效作用,并且不能抑制CTX所致的體重減輕。但是通過對小鼠毛色進行觀察發(fā)現(xiàn),CTX+GLP組小鼠毛色光亮、行動靈敏,明顯強于CTX組,說明GLP能部分調(diào)整CTX所致的副作用,從現(xiàn)有結(jié)果推測,隨著給藥時

8、間的延長,GLP可能會抑制CTX所致的體重減輕。
　　 2采用流式細胞術(shù)觀察PBMC、IEL、LPL、PPL各T淋巴細胞亞群的變化,發(fā)現(xiàn)H22荷瘤小鼠存在著黏膜免疫與系統(tǒng)免疫的變化。結(jié)果顯示,荷瘤小鼠外周血T淋巴細胞亞群(CD3+T淋巴細胞)有下降趨勢,CD4+T淋巴細胞亞群顯著下降,而CD8+T淋巴細胞亞群變化無顯著性差異,導(dǎo)致CD4/CD8比值顯著下降。與正常組比較,H22荷瘤小鼠IEL中CD4+T淋巴細胞亞群明顯上升,CD

9、8+T淋巴細胞亞群無明顯變化,從而引起CD4/CD8比值明顯上升。在肝癌小鼠PPL中各細胞亞群與正常組比較未見明顯差異。在H22荷瘤小鼠模型中,與正常組比較,LPL CD3+T淋巴細胞和CD4+T淋巴細胞亞群變化無顯著性差異,而CD8+T淋巴細胞亞群明顯上升,導(dǎo)致CD4/CD8比值明顯下降。ELISA法對外周血的檢測發(fā)現(xiàn),血清中IL-10含量明顯升高,IL-2含量明顯降低。免疫組化結(jié)果顯示:模型組IgA、IL-2及TNF-α分泌明顯減少

10、,IL-10明顯增加,與正常組相比,差異具有顯著性。以上結(jié)果均反映出H22荷瘤小鼠機體處于一種免疫抑制狀態(tài)。同時注意到此腫瘤模型不同部位的腸道黏膜淋巴細胞(IEL、LPL、PPL)變化表現(xiàn)不一,分析因為可能由于各淋巴細胞在腸道黏膜中的部位不同,接觸抗原的先后及成份不同,因而使其形成了不同表型及免疫功能。
　　 3目前關(guān)于GLP對腫瘤機體腸道黏膜免疫系統(tǒng)的研究未見報道,本課題對此進行了初探,這也是本實驗的創(chuàng)新點。采用流式細胞術(shù)方法

11、檢測T淋巴細胞亞群發(fā)現(xiàn),CTX能明顯升高PPL中CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細胞比例,降低CD4/CD8比值。GLP組與模型組相比,無顯著性差異,但是其能降低由CTX導(dǎo)致的CD3+和CD8+T淋巴細胞亞群顯著升高,抑制CD4/CD8的比值明顯增加的趨勢。CTX、GLP、CTX+GLP組中IEL CD3+T淋巴細胞及CD8+T淋巴細胞亞群與模型組相比,無統(tǒng)計學(xué)意義,其主要變化在CD4+T淋巴細胞。CTX使IEL中的CD4+T淋巴細胞

12、的比例顯著下降,CD4/CD8比值相應(yīng)也顯著降低。GLP亦能使IEL中的CD4+T淋巴細胞的比例及CD4/CD8比值顯著下降,且對CTX所致的CD4+T淋巴細胞降低有提高的趨勢,但無統(tǒng)計學(xué)意義。這個結(jié)果與外周血的結(jié)果完全不同,這可能與IEL的免疫功能有關(guān),具體的機理尚有待進一步探討。與模型組相比,CTX使LPL中CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細胞明顯下降,但是CD4/CD8比值卻明顯升高；GLP對CD3+和CD4+T淋巴細胞無明顯變

13、化,但是由于CD8+T淋巴細胞比例下降,導(dǎo)致CD4/CD8比值明顯上升。GLP能提高CTX誘導(dǎo)的CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細胞的降低,表明GLP能改善CTX導(dǎo)致的免疫功能低下。固有層中T淋巴細胞的主要功能是輔助B淋巴細胞合成和分泌IgA,這種輔助作用是通過T輔助細胞分泌細胞因子實現(xiàn)的。本實驗觀察到CTX使荷瘤小鼠IgA明顯降低,GLP能提高荷瘤小鼠IgA的表達(與正常組比較,P=0.07),并抑制CTX引起IgA的下降(P<0.

14、05)。采用IHC方法檢測腸道內(nèi)IL-2、IL-10、TNF-α的表達,發(fā)現(xiàn)CTX與GLP均能下調(diào)IL-10水平；CTX可以顯著提高荷瘤小鼠IL-2及TNF-α的水平,GLP對荷瘤小鼠IL-2及TNF-α的降低亦有提高作用,并對CTX有協(xié)同增效的趨勢。以上結(jié)果說明GLP可能通過調(diào)節(jié)荷瘤小鼠及CTX化療后小鼠Th1/Th2型細胞因子的比例,提高Th1型細胞因子,增強機體的免疫功能而發(fā)揮作用。GLP對荷瘤小鼠及化療后小鼠眾多腸道黏膜免疫特征

15、的影響作用,證實了我們的推測,即GLP可能通過影響腸道黏膜免疫功能而激發(fā)全身免疫系統(tǒng)而發(fā)揮抗腫瘤的作用。
　　 綜上所述,扶正培本中藥靈芝的提取物GLP能抑制荷瘤小鼠腫瘤生長,并對CTX引起的副作用有部分調(diào)整作用。其作用機制之一是GLP通過某種方式刺激腸道黏膜淋巴細胞,腸道黏膜淋巴細胞通過淋巴細胞再循環(huán),進而激活全身免疫系統(tǒng)而發(fā)揮抗腫瘤的作用。這一結(jié)果表明,GLP是靈芝扶正培本藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)之一,同時也提示臨床采用靈芝及扶正培本