山慈菇多糖的提取及其對(duì)荷瘤小鼠(H22)體內(nèi)和體外的作用機(jī)制的初步研究.pdf

1、惡性腹水是晚期或復(fù)發(fā)惡性腫瘤的一種非常嚴(yán)重和棘手的并發(fā)癥，而臨床上對(duì)其治療，多為穿刺或者靜脈分流術(shù)，但是這些治療方法并不能解決根本問(wèn)題。山慈菇，一種蘭科植物的假鱗莖，在中醫(yī)治療中常常與其它藥物配伍使用，廣泛應(yīng)用于抗炎和抗腫瘤，但其治療惡性腹水的效果尚不清楚。
　　目的：(1)從山慈菇中提取山慈菇多糖，并對(duì)其進(jìn)行濃度測(cè)定，單糖組成，二級(jí)結(jié)構(gòu)以及相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定。(2)建立小鼠H22肝癌細(xì)胞腹水模型，探究山慈菇多糖在小鼠體內(nèi)對(duì)于惡性

2、腹水的作用以及對(duì)其免疫機(jī)制的研究。(3)在體外用山慈菇多糖直接作用于H22肝癌細(xì)胞，并對(duì)其抗腫瘤作用的機(jī)制進(jìn)行初步探究
　　方法：①利用水提醇沉法提取山慈菇多糖，用三氯乙酸除去蛋白，有機(jī)試劑洗滌，透析等方法純化多糖。采用苯酚-硫酸法測(cè)得提取多糖的濃度，用電感耦合等離子體質(zhì)譜進(jìn)行單糖分析，用凝膠滲透色譜法分析多糖的相對(duì)分子質(zhì)量，并用氣相色譜對(duì)該多糖的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。②用H22肝癌細(xì)胞在Balb/c小鼠體內(nèi)建立腹水模型，將不同濃度的

3、山慈菇多糖用腹腔注射法隔天給藥給予治療，并采用同樣的方法用環(huán)磷酰胺做陽(yáng)性對(duì)照，生理鹽水做陰性對(duì)照，七次治療后觀察小鼠的腹圍，體重和生存期。在第18天后隨機(jī)處死一半小鼠，提取脾淋巴細(xì)胞，采用淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)測(cè)定T和B淋巴細(xì)胞的增殖指數(shù);采用E-rose實(shí)驗(yàn)檢測(cè)T細(xì)胞的免疫功能狀態(tài);并用特異性抗體標(biāo)記CD8+和NK細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀分析各組治療后CD8+和NK細(xì)胞的比例;分選小鼠脾淋巴細(xì)胞的CD4+CD25+，提取其mRNA，在mRNA水平

4、上檢測(cè)Foxp3基因的表達(dá)。用免疫組化法在小鼠的腹水細(xì)胞中分析Foxp3和Stat3的表達(dá)。用ELISA法測(cè)定小鼠血清和腹水中相關(guān)免疫因子的變化。并且用ELISA法測(cè)量小鼠血清內(nèi)的甘露糖和葡萄糖的濃度水平。③在體外，用CCK8(Cell Counting Kit-8)法測(cè)山慈菇多糖對(duì)H22小鼠肝癌細(xì)胞及鼠的正常肝上皮細(xì)胞BRL-3A細(xì)胞的增殖抑制率;并用同樣的方法排除甘露糖和葡萄糖對(duì)H22細(xì)胞的影響;采用Hoechest33258和Tu

5、nel法檢測(cè)H22細(xì)胞凋亡情況，并用Western-blot法，ELISA法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)情況，探究山慈菇多糖體外抑制H22細(xì)胞的潛在機(jī)制。
　　結(jié)果：經(jīng)過(guò)提取和純化的山慈菇多糖，測(cè)得其最后的濃度為30mg/mL，對(duì)其進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)山慈菇多糖里含有60％的甘露糖，37％的葡萄糖，還有少量的半乳糖，巖藻糖，木糖，鼠李糖。其重均相對(duì)分子質(zhì)量為383569kDa。山慈菇多糖的二級(jí)結(jié)構(gòu)在180-260nm處，主要是反平行和無(wú)規(guī)卷曲，然后

6、是β-轉(zhuǎn)角和平行螺旋。②在小鼠移植瘤H22惡性腹水模型中，我們發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，山慈菇多糖治療組的小鼠的腹圍和體重明顯減少，而生存率和存活時(shí)間明顯增加了。提取小鼠的脾淋巴細(xì)胞，在脾淋巴細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)和E花環(huán)實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠脾淋巴細(xì)胞的刺激指數(shù)和花環(huán)形成率隨山慈菇多糖濃度的增加而增長(zhǎng)。除此之外，山慈菇多糖提高了小鼠脾淋巴細(xì)胞內(nèi)的CD8+T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的比例。同時(shí)，山慈菇多糖治療組小鼠的脾淋巴細(xì)胞比對(duì)照組小鼠的Foxp3表達(dá)減少。

7、利用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，山慈菇多糖組的小鼠腹水淋巴細(xì)胞對(duì)比對(duì)照組，F(xiàn)oxp3和Stat3表達(dá)隨著山慈菇濃度的升高而減少。而且，山慈菇多糖小鼠血清內(nèi)的細(xì)胞因子IL-2，TNF-α，IFN-γ隨著濃度的增加而分泌增多，VEGF則分泌減少。而山慈菇多糖治療組小鼠血清內(nèi)的甘露糖和葡萄糖的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于對(duì)照組。③體外結(jié)果顯示，山慈菇多糖對(duì)H22腫瘤細(xì)胞有一定的抑制作用，并表現(xiàn)出時(shí)間和濃度依賴(lài)性，48h多糖濃度為4mg/mL時(shí)的抑制率達(dá)到50％。同時(shí)，

8、山慈菇多糖在同等濃度下，對(duì)小鼠正常肝上皮細(xì)胞BRL-3A無(wú)影響。而且在甘露糖和葡萄糖的排除實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)甘露糖和葡萄糖的混合糖溶液在24小時(shí)的低濃度下，對(duì)H22細(xì)胞有很小的促進(jìn)作用，但在高濃度(4mg/mL)下，在48小時(shí)后，該混合糖溶液對(duì)H22細(xì)胞有抑制作用，但最大抑制率不超過(guò)16％，比山慈菇多糖對(duì)H22細(xì)胞的影響要小得多。經(jīng)Hoechest33258染色實(shí)驗(yàn)和Tunel染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡及其半定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，山慈菇多糖能夠誘導(dǎo)H22

9、細(xì)胞凋亡，且其凋亡程度呈現(xiàn)出時(shí)間及濃度的依賴(lài)關(guān)系;ELISA法檢測(cè)細(xì)胞凋亡蛋白結(jié)果表示山慈菇多糖顯著誘導(dǎo)了H22細(xì)胞的Caspase-3和Caspas-8激活;Western-blot結(jié)果顯示：山慈菇多糖治療組比對(duì)照組的Jak1、Stat3和Bcl-2蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著減少，而B(niǎo)ax的表達(dá)增加。定量分析表明，山慈菇多糖顯著抑制了Jak1-Stat3途徑，并提高了Bax/Bcl-2的比例。
　　結(jié)論：1、山慈菇多糖是一個(gè)不均一性多糖

10、，它的主要成分為甘露糖和葡萄糖，還有少量的其它益生糖，其相對(duì)分子質(zhì)量為383.569kDa，二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是在180-260nm的反平行和無(wú)規(guī)卷曲，然后是β-轉(zhuǎn)角和平行螺旋。2、山慈菇多糖可以顯著的減少和延緩小鼠惡性腹水的生成，顯著延長(zhǎng)惡性腹水小鼠的生命。3、山慈菇多糖能夠刺激T細(xì)胞和B細(xì)胞的生長(zhǎng)，增加CD8+和NK淋巴細(xì)胞的比例，促進(jìn)分泌IL-2，IFN-γ和TNF-α，減少VEGF的表達(dá)。此外，PRP可以減少小鼠體內(nèi)的Foxp3和St