豬miR-378種子序列突變對(duì)其功能的影響.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)使用基因克隆、Q-PCR和雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法對(duì)miR-378的種子序列突變以及突變后對(duì)miR-378功能的影響進(jìn)行了相關(guān)研究，獲得了以下結(jié)果:
　　1、利用連聚合酶反應(yīng)(PCR)技術(shù)擴(kuò)增榮昌豬、內(nèi)江豬，長(zhǎng)白豬以及杜洛克的miR-378-2基因的DNA片段，將此片段進(jìn)行測(cè)序，分析發(fā)現(xiàn):榮昌豬和內(nèi)江豬的miR-378-2基因中存在一個(gè)堿基A/G突變，長(zhǎng)白豬和杜洛克豬中并沒有發(fā)現(xiàn)此突變。此突變位于miR-378-2

2、成熟體的種子序列，且突變能夠改變pre-miR-378的二級(jí)結(jié)構(gòu)及自由能。
　　2、利用Q-PCR技術(shù)以及攜帶該突變個(gè)體的miRNA高通量測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)miR-378表達(dá)量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，成熟體miR-378（野生型和突變型）主要分布于心肌、骨骼肌以及皮下脂肪等組織中，說明，miR-378分布具有組織特異性。
　　3、通過構(gòu)建野生型和突變型miR-378串聯(lián)表達(dá)載體，在3T3-L1細(xì)胞中進(jìn)行體外過表達(dá)。發(fā)現(xiàn)，miR-378突變后的

3、表達(dá)量極顯著高于突變前的表達(dá)量，說明，miR-378-2種子序列中A/G突變極顯著增加了miR-378-2的表達(dá)量。
　　4、基于種子序列與3' UTR區(qū)的序列匹配關(guān)系，以人的基因組為參考，對(duì)野生型miR-378和突變型miR-378的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，該突變完全改變了miR-378對(duì)靶基因的識(shí)別，突變型miR-378的靶基因的數(shù)量高于野生型miR-378的靶基因數(shù)量;對(duì)兩種軟件預(yù)測(cè)共有的靶基因進(jìn)行交集和GO分析，結(jié)果顯示

4、，野生型和突變型miR-378具有完全不同的兩種功能趨勢(shì)，野生型miR-378功能主要與RNA相關(guān)的生命過程相關(guān)，部分與脂肪沉積相關(guān);突變型miR-378功能主要與蛋白的降解有關(guān)，無與脂肪沉積相關(guān)的靶基因。
　　5、隨機(jī)挑選部分靶基因，利用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證突變miR-378對(duì)抑制靶基因表達(dá)功能的結(jié)果表明，miR-378突變后出現(xiàn)失去對(duì)部分靶基因的識(shí)別能力（Loss-of-function）和獲得一些新的靶基因（Gain-