透骨消痛顆粒誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的實驗研究.pdf

1、目的:通過對骨髓基質(zhì)細(xì)胞（BMSCs）體外抽取、分離、純化、培養(yǎng)、鑒定和透骨消痛顆粒對BMSCs向軟骨分化過程中Cbfal，Sox9基因表達影響的研究，探討中藥對骨性關(guān)節(jié)炎（OA）的治療機理，為中醫(yī)藥治療骨性關(guān)節(jié)炎提供理論依據(jù)。 方法:（1）抽取SD大鼠骨髓液，采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法經(jīng)體外分離、純化、培養(yǎng)獲得SD大鼠BMSCs，通過倒置相差顯微鏡和電子顯微鏡觀察其生長情況，研究BMSCs的體外生長狀況。第三代BMSCs細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)

2、胞儀檢測CD90、CD45細(xì)胞表面標(biāo)志物。（2）取4周齡SD大鼠48只，隨機分成2組，即：透骨消痛顆粒組（32只），根據(jù)“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”計算，給予相對應(yīng)的給藥量灌胃7天，末次給藥在1小時后進行采血，制備透骨消痛顆粒含藥血清；空白對照組（16只），以等量的生理鹽水灌胃以獲得空白對照血清。將第三代SD大鼠BMSCs分為空白對照組、單純軟骨誘導(dǎo)劑組及透骨消痛顆粒含藥血清組，采用原培養(yǎng)液、軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液（TGF-β310

3、ug/L，Dex10-7mol/L，VitC50mg/L）及透骨消痛顆粒含藥血清培養(yǎng)液，50ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)進行培養(yǎng)，1、2周后通過倒置相差顯微鏡、透射電子顯微鏡、RT-PCR實驗技術(shù)，研究透骨消痛顆粒對BMSCs誘導(dǎo)成軟骨細(xì)胞的影響。（3）數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析：數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用統(tǒng)計軟件SPSS14．0進行統(tǒng)計分析。 結(jié)果:（1）體外培養(yǎng)的BMSCs生長狀況良好，12d可獲得均質(zhì)性較好的BMSCs，實驗證明全骨髓貼壁培養(yǎng)法是

4、分離BMSCs的一種比較理想的方法，BMSCs體外分離培養(yǎng)成功。經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表型：第三代細(xì)胞表達CD90為：97．25%，CD45為：3．26%。這表明培養(yǎng)的BMSCs傳到第3代后純度已達到97%以上，可以為以后的實驗提供純化的細(xì)胞。（2）倒置相差顯微鏡觀察：透骨消痛顆粒組BMSCs彼此融合，聚集生長，向三角形、多角形轉(zhuǎn)變；軟骨誘導(dǎo)劑組BMSCs向圓形、軟圓形轉(zhuǎn)變；空白組BMSCs細(xì)胞繼續(xù)呈梭形均勻生長，形態(tài)單一。透射電鏡觀察：

5、軟骨表型化的BMSCs細(xì)胞多數(shù)為近橢圓形，表面突起多，細(xì)胞核大，含核糖體較多，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池擴張明顯，高爾基體豐富。未呈軟骨表型化的BMSCs細(xì)胞多為梭形或橢圓形，表面突起數(shù)不等，細(xì)胞核多數(shù)呈不規(guī)則形，中等或較小。核基質(zhì)常染色質(zhì)多見，異染色質(zhì)多分布于近核膜處，其粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較不發(fā)達，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池可見擴張，高爾基體不豐富。（3）：RT-PCR：誘導(dǎo)1周：空白對照組無Sox9表達；透骨消痛顆粒組，軟骨誘導(dǎo)劑組均有Sox9表達，且透骨消痛

6、顆粒組與軟骨誘導(dǎo)劑組Sox9表達量無顯著性差異（P>0．05）。各組均無Cbfal的表達。誘導(dǎo)2周：空白對照組無Sox9基因表達，透骨消痛顆粒組，軟骨誘導(dǎo)劑組均有Sox9表達，且透骨消痛顆粒組與軟骨誘導(dǎo)劑組Sox9表達量有非常顯著性差異（P<0．01）?？瞻讓φ战M無Cbfal表達，透骨消痛顆粒組，軟骨誘導(dǎo)劑組均有Cbfal表達，且軟骨誘導(dǎo)劑組與透骨消痛顆粒組Cbfal表達量有顯著性差異（P<0．05）。 結(jié)論:（1）通過體外對S