原癌基因C-met基因在食管鱗癌中的表達及其與COX-2表達相關(guān)性以及COX-2基因表達與細胞增殖、凋亡相關(guān)性研究.pdf

1、目的：
　　 食管癌是消化道常見惡性腫瘤之一,其發(fā)病過程中存在許多原癌基因的激活。C-met是一種由C-met原癌基因編碼的蛋白產(chǎn)物,為肝細胞生長因子受體,具有酪氨酸激酶活性,與多種癌基因產(chǎn)物和調(diào)節(jié)蛋白相關(guān),參與細胞信息傳導、細胞骨架重排的調(diào)控,是細胞增殖、分化和運動的重要因素。目前研究表明,C-met基因與多種惡性腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān),許多腫瘤病人在其腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中均有C-met的過度表達和基因擴增。
　　

2、 當前國內(nèi)外文獻食管鱗癌中C-met表達情況報道較少,因此,本實驗通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)技術(shù)檢測57例食管鱗癌組織和20例癌旁正常食管組織中C-met mRNA的表達,并分析C-met mRNA的表達與臨床病理資料之間的關(guān)系:同時采用免疫組織化學方法檢測了57例食管鱗癌組織和20例癌旁正常食管組織中C-met蛋白及COX-2

3、蛋白的表達,并探討C-met蛋白與COX-2蛋白之間的關(guān)系。本研究還應用流式細胞術(shù),對食管鱗癌細胞的增殖活性和凋亡水平進行檢驗分析,希望證實COX-2表達與食管腫瘤細胞的增殖和凋亡有關(guān)。
　　 材料與方法
　　 一、實驗材料
　　 57例食管鱗癌手術(shù)標本及部分相應的癌旁正常食管組織標本20例來自山東大學省立醫(yī)院胸外科2008年11月-2009年12月間的手術(shù)病例,其中男性46例,女性11例,年齡34～72歲,中位

4、年齡52.9歲。57例腫瘤組織中,13例低分化,28例中分化,16例高分化,26例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。腫瘤部位中段28例,下段29例。腫瘤大小≤5cm32例,>5cm25例。根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(UICC)1997年修訂的食管癌臨床分期標準,Ⅱa期31例,Ⅱb+Ⅲ期26例,食管上段、T4及M1(Ⅳ期)病人不包括在手術(shù)范圍內(nèi)。胸腹部淋巴結(jié)清掃范圍參照美國癌癥聯(lián)合委員會(American Joint Committee on Cancer,AJCC)

5、食管癌淋巴結(jié)分布圖,淋巴結(jié)清掃數(shù)目7～22枚,平均9.6枚。所有患者術(shù)中肉眼大體判斷均達RO切除,術(shù)后病理論斷食管鱗癌,食管上、下切緣均無腫瘤細胞殘留。相應的癌旁正常食管組織標本為術(shù)中采集距離食管癌組織至少5cm以上的正常食管組織。所有患者術(shù)前均未行放、化療治療。
　　 二、實驗方法
　　 1、逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測C-met基因表達
　　 取100mg待檢驗組織,加入1ml Trizol溶液徹底勻漿。參照Trizol

6、試劑盒說明書用一步法提取總RNA,用DNA/RNA測定儀測定RNA濃度和純度。反應體系中力口入10×RNA PCR Buffer1μl、dNTP1μl、MgCl22μl、Random9mers0.5μl、RNA1μl、RNase inhibitor0.25μl、Reverse Transcriptase0.5μl、ddH2O3.75μl。反應條件:30℃10min,42℃30min,99℃5min,5℃5min。
　　 C-me

7、t基因引物序列為5’-TTCACCGCGGAAACACCCATC-3’(上游)和5’-GTCTTCCAGCCAGGCCCAGT-3’(下游)。在12.5μl反應體系中含有滅菌ddH2O
　　 7.16μl、20pmol/L上、下游引物各0.15μl、cDNA2.5μl、Taq Hs0.04μl、5×Buffer2.5μl。反應條件:95℃2min,95℃1min,58℃1min,72℃1min,30個循環(huán)；72℃延伸7min。用

8、內(nèi)參照β-肌動蛋白(β-actin)檢測逆轉(zhuǎn)錄效率。PCR產(chǎn)物用8％的聚丙烯酰胺凝膠電泳,100V,1.5h,電泳結(jié)束后,凝膠自動成像儀進行攝像分析。采用TaKaRa公司100bp梯度Makers為分子量大小對照,確定電泳條帶。
　　 2、免疫組織化學方法檢測C-met、COX-2蛋白表達
　　 采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶連接(Streptavidin-peroxidase S-P)免疫組織化學方法,一抗C-met

9、和COX-2兔抗人多克隆抗體(美國BIOCHEMICALS公司產(chǎn)品),工作濃度1:100,S-P試劑盒購自北京中山公司。實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。將已知陽性胃癌切片為陽性對照,用PBS代替一抗作為陰性對照。胞漿染色為淡黃至棕黃色者為陽性細胞標志,將陽性細胞按其數(shù)量及顯色強度分為3級:弱陽性(+)、陽性(++)和強陽性(+++)。
　　 3、流式細胞術(shù)檢測食管鱗癌細胞的增殖活性和凋亡水平
　　 取材深低溫保存的組織

10、,采用網(wǎng)挫方法制備單細胞懸液,以PBS調(diào)整細胞數(shù)為1×106/ml。其中一份加入PI染色液1ml(PI染色液包含PI5mg,Rnase2mg,TritonX-1001ml,生理鹽水65ml,枸椽酸鈉100mg,加蒸餾水至100ml),置4℃冰箱中避光染色30min后進行分析。另一份加入FITC-AnnexinV及PI各5μl,室溫下避光靜置15min后進行分析。
　　 使用的流式細胞儀為FACSCalibur型(B.D,USA)

11、。光源為488nm氬離子激光器,FITC受激發(fā)后發(fā)綠色熒光,PI發(fā)紅色熒光,每份標本計數(shù)10000個細胞,然后在Macintosh9.5計算機上用相關(guān)軟件分析數(shù)據(jù)。測量前,以人淋巴細胞作為標準品調(diào)校儀器的CV值在3.0％以內(nèi)。應用MetaMorph(CellQuest3.0)細胞周期分析軟件,計算DNA組方圖各時相分布的百分比,以增殖指數(shù)(proliferationindex,PI)表示增殖活性。二維點陣圖上FITC高染而PI低染者為早

12、期凋亡細胞,計算其所占的百分比。
　　 三、統(tǒng)計學分析
　　 計數(shù)資料采用X2檢驗,計量資料采用t檢驗,用SPSS13.0軟件處理。
　　 結(jié)果
　　 1、C-met基因在食管鱗癌組織中的表達情況
　　 C-met基因在57例食管鱗癌組織中陽性表達率為52.6％(30/57),而在20例癌旁正常食管組織中低表達,陽性率為5.0％(1/20),兩者之間有顯著性差異(P<0.01)。
　　 2

13、、C-met基因的表達與食管鱗癌組織臨床病理資料的關(guān)系
　　 C-met基因的表達與食管鱗癌患者的年齡、性別、病變長度和癌組織分化程度無關(guān)(P>0.05),而與鱗癌組織浸潤深度(P<0.05)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)(P<0.01)。
　　 3、食管鱗癌組織中C-met蛋白表達與COX-2蛋白表達的相關(guān)性
　　 C-met蛋白在57例食管鱗癌組織中陽性表達率為52.6％(30/57),而在20例癌旁正常食管組

14、織中低表達,陽性率為5.0％(1/20),兩者之間有顯著性差異(P<0.01)。在食管鱗癌組織中,C-met蛋白的表達與癌組織浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān),而與患者年齡、性別、病變長度和癌組織分化程度無關(guān)(P>0.05)。
　　 COX-2蛋白在57例食管鱗癌組織中有40例陽性表達(陽性率為70.2％),而20例癌旁正常組織僅1例呈陽性表達(陽性率為5.0％),兩者之間有顯著性差異(P<0.01)。在食管鱗癌組織中,CO

15、X-2蛋白的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)(P<0.05),而與患者年齡、性別、病變長度、癌組織浸潤深度和組織分化程度無關(guān)(P>0.05)。
　　 30例C-met蛋白表達陽性的食管鱗癌組織中有26例COX-2蛋白陽性表達,27例C-met蛋白表達陰性的食管鱗癌組織中有14例COX-2蛋白呈陽性表達,經(jīng)統(tǒng)計學檢驗分析,C-met蛋白表達與COX-2蛋白表達呈正相關(guān)(r=0.436,x2=8.203,P=0.004)。
　

16、　 4、食管鱗癌組織中COX-2基因表達與腫瘤細胞增殖的相關(guān)性
　　 通過免疫組織化學方法檢測的57例食管鱗癌組織的細胞增殖指數(shù)(PI)平均為(30.14±4.99)％。57例患者中40例COX-2蛋白陽性表達,17例COX-2蛋白陰性表達,食管鱗癌細胞增殖指數(shù)(PI)分別為(31.41±5.14)％和(27.15±4.66)％,兩者比較有顯著性差異(t=6.933,p<0.01)。
　　 5、食管鱗癌組織中COX-2

17、基因表達與腫瘤細胞早期凋亡的相關(guān)性
　　 通過免疫組織化學方法檢測的57例食管鱗癌組織的早期凋亡率平均為(2.18±0.78)％。57例患者中40例COX-2蛋白陽性表達,17例COX-2蛋白陰性表達,食管鱗癌細胞早期凋亡率分別為(1.97±0.71)％和(2.66±0.94)％,兩者比較有顯著性差異(t=4.831,,p<0.01)。
　　 結(jié)論
　　 1、C-met基因在食管鱗癌中呈高表達,而在癌旁正常食管組

18、織中低表達。
　　 2、C-met基因的表達與食管鱗癌患者的年齡、性別、病變長度和癌組織分化程度無關(guān),而與癌組織浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)。
　　 3、COX-2基因在食管鱗癌中呈高表達,而在癌旁正常食管組織中低表達。
　　 4、COX-2基因的表達與食管鱗癌患者的年齡、性別、病變長度、癌組織浸潤深度和組織分化程度無關(guān),而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)。
　　 5、食管鱗癌組織中C-met蛋白表達