鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Zip11的功能及沙門(mén)氏菌攻擊對(duì)肉雞鋅穩(wěn)態(tài)的影響及調(diào)控機(jī)理研究.pdf

1、鋅是機(jī)體必需的微量元素，機(jī)體需要準(zhǔn)確地調(diào)節(jié)鋅穩(wěn)態(tài)平衡，讓鋅水平維持在正常的范圍內(nèi)。機(jī)體的鋅穩(wěn)態(tài)調(diào)控主要是由鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ZNT與ZIP家族負(fù)責(zé)。ZIP11則是ZIP家族全新的基因，之前尚未見(jiàn)關(guān)于ZIP11功能的研究報(bào)道。由沙門(mén)氏菌污染禽肉引起的人食源性疾病仍然是世界衛(wèi)生組織面臨的主要問(wèn)題之一。肉雞大腸桿菌感染或內(nèi)毒素刺激均會(huì)出現(xiàn)典型的“低鋅血癥”，血清鋅降低，肝臟鋅升高;同時(shí)多項(xiàng)研究暗示病原微生物感染可能會(huì)影響機(jī)體先天免疫細(xì)胞（如中性粒細(xì)胞

2、與巨噬細(xì)胞）的鋅穩(wěn)態(tài)。但沙門(mén)氏菌感染對(duì)肉雞鋅穩(wěn)態(tài)的影響與調(diào)控機(jī)理目前仍不清楚。鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在其中的作用也是未知，ZIP11是否參與其中有待研究。本研究將全面系統(tǒng)地回答這些問(wèn)題，共開(kāi)展以下三項(xiàng)研究:
　　實(shí)驗(yàn)一:ZIP11在機(jī)體鋅代謝中的作用與機(jī)理研究
　　本研究以野生型小鼠與細(xì)胞系為模型，全面系統(tǒng)地研究ZIP11在機(jī)體鋅代謝中的作用與機(jī)理。首先通過(guò)生物信息學(xué)分析ZIP家族在真核上的分布規(guī)律與進(jìn)化關(guān)系，從不同的真核生物類(lèi)群（如哺

3、乳動(dòng)物、脊椎動(dòng)物、植物與原生動(dòng)物等）中挑選了25種具有代表性的真核生物的ZIP基因進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ZIP11是ZIP家族gufA亞家族的唯一成員，起源于真核生物早期的祖先。在分析Zip11在小鼠不同組織中的表達(dá)規(guī)律，發(fā)現(xiàn)mZip11在消化系統(tǒng)中高表達(dá)（胃、回腸與盲腸）。而在HEK293T細(xì)胞上轉(zhuǎn)染mZIP11質(zhì)粒與在RAW26.7細(xì)胞上沉默Zip11后，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)鋅含量與MT的基因表達(dá)，證實(shí)ZIP11是一個(gè)鋅的轉(zhuǎn)入蛋白。給野生型小鼠

4、補(bǔ)鋅后，發(fā)現(xiàn)Zip11無(wú)論是mRNA還是蛋白水平均顯著升高。隨后的熒光素酶報(bào)告基因分析發(fā)現(xiàn)Zip11第一個(gè)外顯子上游區(qū)域存在多個(gè)MRE序列，可響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)鋅的變化。突變分析的結(jié)果發(fā)現(xiàn)很多MRE可調(diào)控Zip11啟動(dòng)子的活性，MTF-1參與到Zip11表達(dá)調(diào)控的過(guò)程中?？傊?，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ZIP11具有特殊的序列與結(jié)構(gòu)特征，負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)鋅的轉(zhuǎn)運(yùn)，鋅通過(guò)MTF-1綁定到Zip11啟動(dòng)子區(qū)域的MRE序列上調(diào)控Zip11的基因表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)二

5、:沙門(mén)氏菌感染對(duì)肉雞鋅穩(wěn)態(tài)的影響及調(diào)控機(jī)理研究
　　實(shí)驗(yàn)選用48只1dAA肉公雞，飼養(yǎng)7d后按體重?zé)o差異原則隨機(jī)分為兩組:一組為對(duì)照組，另外一組為沙門(mén)氏菌攻毒組。分別在攻毒后第1、3與7d收集血清、肝臟、脾臟、胸腺、法氏囊、十二指腸、空腸、回腸與盲腸等組織，用于鋅含量與鋅代謝相關(guān)基因的分析。同時(shí)，分離正常與被感染雞只的血液中性粒細(xì)胞，檢測(cè)鈣衛(wèi)蛋白與鋅代謝相關(guān)基因的表達(dá)。研究表明，7d肉雞沙門(mén)氏菌感染后血清鋅顯著降低(P＜0.05)

6、，肝臟鋅明顯升高(P＜0.05)，機(jī)體出現(xiàn)了典型的“低鋅血癥”。與對(duì)照組相比感染組十二指腸中鋅含量極顯著降低(P＜0.01)，但法氏囊與盲腸中的鋅含量顯著升高(P＜0.05)。機(jī)體通過(guò)限制十二指腸對(duì)鋅的吸收，同時(shí)將鋅重分布到肝臟、法氏囊與盲腸等組織，從整體上調(diào)控鋅的穩(wěn)態(tài)平衡，來(lái)限制沙門(mén)氏菌對(duì)鋅的吸收與利用。除此之外，沙門(mén)氏菌感染后極顯著地增加中性粒細(xì)胞MT與S100A9的表達(dá)(P＜0.01)。機(jī)體通過(guò)改變中性粒細(xì)胞的鋅穩(wěn)態(tài)，從而介導(dǎo)鈣衛(wèi)

7、蛋白的表達(dá)與分泌，分泌到腸腔中的鈣衛(wèi)蛋白會(huì)螯合掉食糜中的鋅，進(jìn)一步限制沙門(mén)氏菌對(duì)鋅的吸收與利用。沙門(mén)氏菌感染對(duì)肉雞的鋅穩(wěn)態(tài)的影響主要是通過(guò)顯著改變宿主鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的(P＜0.05)。宿主通過(guò)上調(diào)鋅的轉(zhuǎn)入蛋白ZIP14，下調(diào)鋅的轉(zhuǎn)出蛋白ZNT1、ZNT4、ZNT5、ZNT6、ZNT8與ZNT9的表達(dá)將鋅重分布到肝臟;此外下調(diào)ZIP5、ZIP10、ZIP11、ZIP12、ZIP13與ZIP14在十二指腸中的表達(dá)，限制鋅的吸收。進(jìn)一

8、步研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體會(huì)上調(diào)中性粒細(xì)胞中的鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ZIP3、ZIP8、ZIP10與ZIP14的表達(dá)，增加中性粒細(xì)胞中的鋅含量，從而極顯著增加鈣衛(wèi)蛋白的表達(dá)(P＜0.01)。總之，沙門(mén)氏菌感染顯著影響肉雞的鋅穩(wěn)態(tài)。機(jī)體通過(guò)調(diào)控鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)在整體水平與細(xì)胞水平上分別介導(dǎo)鋅穩(wěn)態(tài)調(diào)控，來(lái)共同抵抗沙門(mén)氏菌的感染。多個(gè)鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在這個(gè)過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，ZIP11也參與到其中。
　　實(shí)驗(yàn)三:巨噬細(xì)胞游離鋅調(diào)控在抗沙門(mén)氏菌感染中的作用與機(jī)理研

9、究
　　本研究以RAW264.7巨噬細(xì)胞為模型，在沙門(mén)氏菌感染的同時(shí)，通過(guò)添加鋅或鋅螯合劑改變巨噬細(xì)胞內(nèi)游離鋅的水平，利用熒光顯微、流式細(xì)胞儀、RT-PCR與免疫印跡等技術(shù)檢考察游離鋅改變對(duì)沙門(mén)氏菌感染與增殖的影響;同時(shí)考察游離鋅改變對(duì)宿主NF-κB信號(hào)通路以及ROS與RNS產(chǎn)生的影響。除此之外，還在MT1敲除的RAW264.7巨噬細(xì)胞上驗(yàn)證之前的結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)在巨噬細(xì)胞感染沙門(mén)氏菌后游離鋅會(huì)聚集在巨噬細(xì)胞內(nèi)，并影響沙門(mén)氏菌的感染

10、。螯合巨噬細(xì)胞內(nèi)的游離鋅通過(guò)增加巨噬細(xì)胞ROS與RNS的產(chǎn)生，增加巨噬細(xì)胞對(duì)沙門(mén)氏菌的殺傷，從而減少沙門(mén)氏菌的感染。相反，額外增加巨噬細(xì)胞的水平通過(guò)影響NF-κB p65的激活，減少ROS與RNS的產(chǎn)生，結(jié)果沙門(mén)氏菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)得更好。在敲掉細(xì)胞內(nèi)重要的游離鋅綁定蛋白MT1后，沙門(mén)氏菌在MT1敲除的巨噬細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)的更好。這是由于伴隨巨噬細(xì)胞內(nèi)游離鋅含量升高的同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ROS與RNS的產(chǎn)生也減少。深入研究發(fā)現(xiàn)沙門(mén)氏菌陽(yáng)性的細(xì)胞相比沙

11、門(mén)氏菌陰性的細(xì)胞含有更多的自由鋅，而ROS與RNS的產(chǎn)生被抑制。這暗示感染后巨噬細(xì)胞游離鋅的聚集可能是沙門(mén)氏菌逃避NF-κB介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞殺傷，長(zhǎng)久地在巨噬細(xì)胞內(nèi)生存的新策略。
　　綜上所述，ZIP11是一個(gè)鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在機(jī)體鋅代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用。此外，ZIP11的mRNA與蛋白水平均受鋅調(diào)控，鋅調(diào)控ZIP11的表達(dá)主要通過(guò)MTF-1綁定到ZIP11啟動(dòng)子區(qū)域的MRE序列上來(lái)實(shí)現(xiàn)。肉雞沙門(mén)氏菌感染后，機(jī)體通過(guò)調(diào)控十二指腸鋅的吸