沙門氏菌外膜蛋白的研究.pdf

1、沙門氏菌屬于腸桿菌科,是可引起人畜共患病的革蘭氏陰性桿菌。沙門氏菌外膜蛋白可誘導巨噬細胞凋亡,協(xié)助細菌具有耐藥性,并作為毒力因子在細菌的致病過程中發(fā)揮重要作用。本論文通過對甲型副傷寒沙門氏菌四種外膜蛋白基因btuB、mipA、nmpC和pagC的分布進行了初步研究并對編碼的外膜蛋白BtuB、MipA、NmpC和PagC的免疫原性進行了評價,此外對mipA基因在鼠傷寒沙門氏菌中的功能進行了探究。
　　一、btuB、mipA、nmpC

2、和pagC四種基因在腸道細菌中的研究。本實驗室在前期研究中通過免疫蛋白質(zhì)組學篩選到四個具有強免疫原性的外膜蛋白BtuB、MipA、NmpC和PagC,編碼四種蛋白的基因分別為btuB、mipA、nmpC和pagC。應用PCR基因擴增技術,檢測上述四種基因在141株腸道細菌中的分布情況。結(jié)果顯示在大腸埃希氏菌和志賀氏菌未攜帶nmpC和pagC基因,部分沙門氏菌株攜帶這兩種基因,值得注意的是與甲型副傷寒沙門氏菌不同,傷寒沙門氏菌不具有nmp

3、C基因。上述結(jié)果為傷寒類疾病的臨床診斷及新疫苗研發(fā)提供了參考。
　　二、BtuB、NmpC和PagC外膜蛋白免疫原性的研究。利用陰離子交換法及固化金屬離子親和層析方法對甲型副傷寒沙門氏菌的外膜蛋白NmpC、PagC、his-NmpC和his-PagC進行純化,獲得純度大于90％的目的蛋白。首先,NmpC和PagC蛋白分別與鋁佐劑及殼聚糖結(jié)合后,免疫小鼠后檢測抗體,結(jié)果顯示鋁佐劑結(jié)合組的抗體滴度與殼聚糖結(jié)合組并無顯著差異;其次,通過

4、與鋁佐劑結(jié)合,his-BtuB、his-NmpC,和his-PagC聯(lián)合免疫小鼠后,發(fā)現(xiàn)IgG抗體滴度差異顯著;最后,NmpC、PagC、his-NmpC和his-PagC分別與鋁佐劑結(jié)合后免疫小鼠,實驗結(jié)果顯示,組氨酸標簽具有一定的免疫原性,帶標簽免疫組的抗體滴度與無標簽免疫組差異顯著。
　　三、鼠傷寒沙門氏菌mipA基因功能的研究。利用分子生物學技術構(gòu)建mipA同源突變盒,結(jié)合λ-Red噬菌體重組系統(tǒng),將卡那基因替代鼠傷寒沙門

5、氏菌基因組mipA基因,成功構(gòu)建了50013△mipA::kan缺失株,50013mipAH互補株,50333△mipA::kan缺失株,50333mipAH互補株。通過血清學實驗及生理生化鑒定,結(jié)果顯示mipA缺失并不影響細菌的表型和生理生化特性;通過毒力評價實驗結(jié)果顯示,mipA基因缺失后50013△mipA::kan缺失株侵襲能力遠遠大于50013野生株和50013mipAH互補株,mipA過表達株50013mipAH侵襲能力較5