沙門氏菌外膜蛋白的研究.pdf

1、沙門氏菌屬于腸桿菌科,是可引起人畜共患病的革蘭氏陰性桿菌。沙門氏菌外膜蛋白可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡,協(xié)助細(xì)菌具有耐藥性,并作為毒力因子在細(xì)菌的致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本論文通過(guò)對(duì)甲型副傷寒沙門氏菌四種外膜蛋白基因btuB、mipA、nmpC和pagC的分布進(jìn)行了初步研究并對(duì)編碼的外膜蛋白BtuB、MipA、NmpC和PagC的免疫原性進(jìn)行了評(píng)價(jià),此外對(duì)mipA基因在鼠傷寒沙門氏菌中的功能進(jìn)行了探究。
　　一、btuB、mipA、nmpC

2、和pagC四種基因在腸道細(xì)菌中的研究。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中通過(guò)免疫蛋白質(zhì)組學(xué)篩選到四個(gè)具有強(qiáng)免疫原性的外膜蛋白BtuB、MipA、NmpC和PagC,編碼四種蛋白的基因分別為btuB、mipA、nmpC和pagC。應(yīng)用PCR基因擴(kuò)增技術(shù),檢測(cè)上述四種基因在141株腸道細(xì)菌中的分布情況。結(jié)果顯示在大腸埃希氏菌和志賀氏菌未攜帶nmpC和pagC基因,部分沙門氏菌株攜帶這兩種基因,值得注意的是與甲型副傷寒沙門氏菌不同,傷寒沙門氏菌不具有nmp

3、C基因。上述結(jié)果為傷寒類疾病的臨床診斷及新疫苗研發(fā)提供了參考。
　　二、BtuB、NmpC和PagC外膜蛋白免疫原性的研究。利用陰離子交換法及固化金屬離子親和層析方法對(duì)甲型副傷寒沙門氏菌的外膜蛋白NmpC、PagC、his-NmpC和his-PagC進(jìn)行純化,獲得純度大于90％的目的蛋白。首先,NmpC和PagC蛋白分別與鋁佐劑及殼聚糖結(jié)合后,免疫小鼠后檢測(cè)抗體,結(jié)果顯示鋁佐劑結(jié)合組的抗體滴度與殼聚糖結(jié)合組并無(wú)顯著差異;其次,通過(guò)

4、與鋁佐劑結(jié)合,his-BtuB、his-NmpC,和his-PagC聯(lián)合免疫小鼠后,發(fā)現(xiàn)IgG抗體滴度差異顯著;最后,NmpC、PagC、his-NmpC和his-PagC分別與鋁佐劑結(jié)合后免疫小鼠,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,組氨酸標(biāo)簽具有一定的免疫原性,帶標(biāo)簽免疫組的抗體滴度與無(wú)標(biāo)簽免疫組差異顯著。
　　三、鼠傷寒沙門氏菌mipA基因功能的研究。利用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建mipA同源突變盒,結(jié)合λ-Red噬菌體重組系統(tǒng),將卡那基因替代鼠傷寒沙門

5、氏菌基因組mipA基因,成功構(gòu)建了50013△mipA::kan缺失株,50013mipAH互補(bǔ)株,50333△mipA::kan缺失株,50333mipAH互補(bǔ)株。通過(guò)血清學(xué)實(shí)驗(yàn)及生理生化鑒定,結(jié)果顯示mipA缺失并不影響細(xì)菌的表型和生理生化特性;通過(guò)毒力評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,mipA基因缺失后50013△mipA::kan缺失株侵襲能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于50013野生株和50013mipAH互補(bǔ)株,mipA過(guò)表達(dá)株50013mipAH侵襲能力較5