MUC1對食管癌細(xì)胞生長及其化療藥物治療食管癌效應(yīng)的影響.pdf

1、MUC1粘蛋白(簡稱MUC1)是一種高分子量Ⅰ型跨膜糖蛋白，它的跨膜序列如棒狀插入細(xì)胞膜，其主要結(jié)構(gòu)是由多肽骨架和O-糖甘鍵連接的糖基側(cè)鏈構(gòu)成。在正常情況下，主要廣泛分布于機(jī)體各黏膜表面，包括消化道、呼吸道、乳腺、卵巢、泌尿生殖道等的腺上皮細(xì)胞管腔頂端，起到潤滑和保護(hù)上皮細(xì)胞免受外界侵襲作用。
　　食管癌，一種由食管黏膜上皮或腺體發(fā)生的惡性腫瘤，目前已成為消化道最常見的惡性腫瘤之一。在本次的研究中我們使用MUC1-siRNA穩(wěn)定沉

2、默的Ec1.71細(xì)胞株觀察MUC1對食管癌細(xì)胞增殖和侵襲功能的影響，然后使用裸鼠荷瘤模型調(diào)查其對體內(nèi)腫瘤生長的影響和對常規(guī)化療藥物5－FU、紫杉醇和順鉑治療腫瘤作用的影響，并最終初步探討其可能的機(jī)理。為臨床上伴有MUCl過表達(dá)的食管癌患者的選擇性化療用藥或個(gè)體化化療用藥提供實(shí)驗(yàn)參考。
　　二、研究內(nèi)容：
　?。ㄒ唬㎝UC1靶向小干擾RNA沉默對食管癌Ec1.71細(xì)胞的影響
　　1.MUC1穩(wěn)定沉默細(xì)胞株驗(yàn)證。
　

3、　2.MUC1對Ec1.71細(xì)胞增殖的影響。
　　3.MUC1對Ec1.71細(xì)胞體外成瘤能力的影響。
　?。ǘ┏聊琈UC1分子對食管癌裸鼠移植腫瘤的影響
　　1.食管癌Ec1.71細(xì)胞移植腫瘤在體內(nèi)的生長情況。
　　2.對接種在體內(nèi)的MUC1-siRNA穩(wěn)定沉默的食管癌Ec1.71細(xì)胞中MUC1蛋白表達(dá)的影響。
　　3.MUC1分子對食管癌Ec1.71細(xì)胞移植瘤生長的影響。
　?。ㄈ㎝UC1分子對

4、5-氟尿嘧啶和順鉑化療食管癌效果的影響
　　1.MUC1分子沉默或過表達(dá)對種植腫瘤形成的影響。
　　2.5-FU和順鉑對MUC1過表達(dá)/穩(wěn)定沉默種植瘤裸鼠體重的影響。
　　3.5-FU和順鉑對MUC1過表達(dá)/穩(wěn)定沉默種植瘤體積及體積/體重比率的影響；
　?。ㄋ模㎝UC1分子對紫杉醇和順鉑化療食管癌效果的影響
　　1.紫杉醇和順鉑對MUC1過表達(dá)/穩(wěn)定沉默種植瘤裸鼠體重的影響。
　　2.紫杉醇和順鉑對M

5、UC1過表達(dá)/穩(wěn)定沉默種植瘤體積及體積/體重比率的影響。
　　3.紫杉醇和順鉑對MUC1過表達(dá)/穩(wěn)定沉默種植瘤增殖調(diào)控因子Ki-67及凋亡調(diào)控因子Bcl-2表達(dá)影響。
　?。ㄎ澹㎝UC1分子對腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響
　　1.MUC1分子對PCNA表達(dá)的影響。
　　2.MUC1分子對Bax和Bcl-2凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。
　　3.MUC1分子對細(xì)胞色素c釋放的影響。
　　4.MUC1分子對casp

6、ase-3蛋白的表達(dá)影響。
　　三、試驗(yàn)方法：
　　（一）細(xì)胞培養(yǎng)：人食管癌細(xì)胞Ec1.71在含有10％胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中于37℃，5%CO2的條件下培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)液隔天更換。
　?。ǘ┹d體MUC1-siRNA構(gòu)建：由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞分化與凋亡實(shí)驗(yàn)室提供。
　?。ㄈ┘?xì)胞轉(zhuǎn)染：將Ec1.71細(xì)胞以濃度為2×105接種于24孔板內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞融合度達(dá)到大于60%是開始準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染，細(xì)胞用無血血清的培養(yǎng)

7、基并加入轉(zhuǎn)染復(fù)合物在37℃孵育箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)換位正常的細(xì)胞培養(yǎng)基；細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果。
　?。ㄋ模￤esternblot:將細(xì)胞完全收集，然后提取蛋白、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉蛋白、孵一抗、孵二抗、曝光，以分析細(xì)胞中靶蛋白的表達(dá)水平。
　　四、結(jié)果：
　?。ㄒ唬㎝UC1靶向小干擾RNA沉默對食管癌細(xì)胞Ec1.71的影響
　　1.MUC1穩(wěn)定沉默細(xì)胞株驗(yàn)證：應(yīng)用Western blot方法對上海交通大學(xué)醫(yī)

8、學(xué)院細(xì)胞分化與凋亡實(shí)驗(yàn)室提供的MUC1穩(wěn)定沉默的Ec1.71細(xì)胞株內(nèi)MUC1蛋白的表達(dá)程度進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示MUC1分子在Ec1.71細(xì)胞內(nèi)可被完全沉默。
　　2.沉默MUC1的表達(dá)可以降低Ec1.71細(xì)胞的增殖：利用MTT方法對Ec1.71細(xì)胞的的生長能力進(jìn)行了評(píng)估，結(jié)果顯示Ec1.71/MUC1-siRNA細(xì)胞的生長速度與Ec1.71/CTL-siRNA細(xì)胞比較出現(xiàn)顯著的降低。
　　3.沉默MUC1的表達(dá)可以有效的抑制E

9、c1.71細(xì)胞在體外的成瘤能力；利用軟瓊脂克隆法對MUC1-siRNA沉默MUC1的Ec1.71細(xì)胞外腫瘤形成能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，Ec1.71/MUC1-siRNA細(xì)胞克隆形成率的數(shù)量和大小顯著低于對照組所形成的細(xì)胞克隆率。
　?。ǘ┏聊琈UC1分子對食管癌裸鼠移植腫瘤的影響
　　1.食管癌Ec1.71細(xì)胞能在裸鼠體內(nèi)正常成瘤：裸鼠在接種到食管癌Ec1.71細(xì)胞，第11天接種裸鼠皮下可出現(xiàn)直徑約為0.5cm×0.5cm大小的質(zhì)韌

10、結(jié)節(jié)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束是荷瘤裸鼠生長狀況良好，無一死亡。
　　2.MUC1-siRNA有效的抑制體內(nèi)接種的Ec1.71細(xì)胞內(nèi)MUC1的表達(dá)：使用MUCI-siRNA穩(wěn)定沉默MUC1分子的Ec1.71細(xì)胞在體內(nèi)的成瘤組織細(xì)胞的MUC1蛋白的表達(dá)與對照組比較顯著降低甚至消失。
　　3.MUC1分子對食管癌腫瘤的生長具有抑制作用：MUC1-siRNA轉(zhuǎn)染的Ec1.71細(xì)胞在體內(nèi)形成的瘤組織顯著低于對照組CTL-siRNA轉(zhuǎn)染Ec1.71細(xì)

11、胞所形成的瘤組織。
　?。ㄈ㎝UC1分子對5-氟尿嘧啶和順鉑治療食管癌效果的影響：
　　1.MUC1分子在體內(nèi)植腫瘤形成中起到重要作用：MUC1分子沉默后形成的腫瘤大小顯著小于MUC1分子過表達(dá)時(shí)所形成的。
　　2.5-FU和順鉑對MUC1過表達(dá)/穩(wěn)定沉默種植瘤裸鼠體重的影響不同：在MUC1穩(wěn)定沉默組，5-FU可以使裸鼠體重增加；在MUC1過表達(dá)組，5-氟尿嘧啶可以使裸鼠體重稍有增加，而順鉑使裸鼠體重顯著減少。

12、>　　3.5-FU和順鉑對MUC1過表達(dá)/穩(wěn)定沉默種植瘤體積及體積/體重比率的影響不同：在MUC1穩(wěn)定沉默裸鼠5-FU及順鉑組均未看到明顯的腫瘤體積抑制效應(yīng)；在MUC1過表達(dá)裸鼠，觀察時(shí)間結(jié)束時(shí)5-FU腫瘤體積抑瘤率為11.7%，順鉑腫瘤體積抑瘤率為32.8%。
　?。ㄋ模㎝UC1分子對紫杉醇和順鉑化療食管癌效果的影響
　　1.紫杉醇和順鉑對MUC1過表達(dá)/穩(wěn)定沉默種植瘤裸鼠體重的影響不同：在MUC1穩(wěn)定沉默組，紫杉醇可以使

13、裸鼠體重稍有增加；在MUC1過表達(dá)組，紫杉醇及順鉑都可以使裸鼠體重減少，紫杉醇對裸鼠體重影響小于順鉑。
　　2.紫杉醇和順鉑對MUC1過表達(dá)/穩(wěn)定沉默種植瘤體積及體積/體重比率的影響不同：在MUC1穩(wěn)定沉默裸鼠，紫杉醇及順鉑組均未看到明顯的腫瘤體積抑制效應(yīng)；在MUC1過表達(dá)裸鼠，觀察時(shí)間結(jié)束時(shí)紫杉醇腫瘤體積抑瘤率為23.1%，順鉑腫瘤體積抑瘤率為32.8%。
　　3.紫杉醇和順鉑對MUC1過表達(dá)/穩(wěn)定沉默種植瘤增殖調(diào)控因子K

14、i-67及凋亡調(diào)控因子Bcl-2表達(dá)影響不同：Ki-67組織染色顯示在紫杉醇與順鉑處理組，增殖調(diào)控因子Ki-67呈下調(diào)趨勢；Bcl-2組織染色顯示，在紫杉醇與順鉑處理組，凋亡調(diào)控因子Bcl-2呈上調(diào)趨勢。
　?。ㄎ澹㎝UC1分子對腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響：
　　1.MUC1過表達(dá)／穩(wěn)定沉默對腫瘤組織內(nèi)PCNA表達(dá)的影響不同：在MUC1過表達(dá)的腫瘤組織內(nèi)PCNA表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)量與MUC1沉默的腫瘤組織中的比較顯著提高。

15、>　　2.MUC1過表達(dá)／穩(wěn)定沉默對腫瘤組織內(nèi)Bax蛋白和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響不同：在MUC1過表達(dá)的腫瘤組織內(nèi)Bax蛋白表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)量與MUC1沉默的腫瘤組織中的顯著降低；而在MUC1過表達(dá)的腫瘤組織內(nèi)Bcl-2蛋白表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)量與MUC1沉默的腫瘤組織中的比較顯著提高。
　　3.MUC1過表達(dá)／穩(wěn)定沉默對腫瘤組織內(nèi)細(xì)胞色素c釋放的影響不同：在MUC1過表達(dá)的腫瘤組織內(nèi)細(xì)胞色素c釋放的陽性細(xì)胞數(shù)量與MUC1沉默的腫瘤

16、組織中的比較顯著降低。
　　五、討論：
　　本次實(shí)驗(yàn)我們首先觀察MUC1分子穩(wěn)定沉默后Ec1.71食管癌細(xì)胞增殖速度和侵襲能力的影響，接著將MUC1穩(wěn)定沉默的EC1.71食管癌接種在裸鼠體內(nèi)檢測MUC1分子對體內(nèi)的生長影響，并與MUC1高表達(dá)的C-7食管癌細(xì)胞進(jìn)行對比性研究，觀察MUC1蛋白對目前一線的抗腫瘤化療藥物5-FU、紫杉醇和順鉑治療腫瘤的效果的影響，為臨床上食管癌的治療提供一個(gè)初步的用藥參考。最后我們將初步探討MU

17、C1過表達(dá)和沉默時(shí)對腫瘤細(xì)胞增勢和凋亡的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MUC1分子沉默后食管癌Ec1.71細(xì)胞的增勢能力和侵襲能力都減弱，將MUC1分子沉默的食管癌Ec1.71細(xì)胞接種于裸鼠體內(nèi)，形成腫瘤的生長情況于體外實(shí)驗(yàn)相似，腫瘤組織生長速度與對照組比較顯著緩慢。
　　5-FU是細(xì)胞周期性特異阻斷藥物,其功能是抑制DNA的合成，使細(xì)胞不能完成腫瘤分裂過程，最終抑制腫瘤的增長，促使細(xì)胞發(fā)生凋亡；紫杉醇是新型抗微管藥物，通過促進(jìn)微管蛋白聚合，

18、保持微管蛋白穩(wěn)定，抑制細(xì)胞有絲分裂，使細(xì)胞中止于對放療敏感的G2和M期；順鉑，通過形成DDP～DNA復(fù)合物，干擾DNA復(fù)制，細(xì)胞阻滯于S期，不能進(jìn)人G2/M期，增殖受抑，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡，這些藥物對腫瘤的抑制作用基本是通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增勢和凋亡過程來實(shí)現(xiàn)的。因此，我們在本次研究中初步探討了MUC1分子過表達(dá)和沉默后對體內(nèi)腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響，為其更為深入的機(jī)制研究進(jìn)行一定的理論鋪墊，也為臨床上食管癌腫瘤的個(gè)體化治療及化療藥物的選擇提供了