TLR-4及NF-κB信號轉(zhuǎn)導通路在大鼠慢性高眼壓視網(wǎng)膜損傷中的作用及機制的探討.pdf

1、目前青光眼已被列為世界上第二位的致盲眼病，但其發(fā)病機制還不十分清楚，世界上尚無一種視神經(jīng)保護藥物能夠通過美國的食品藥品監(jiān)督管理局的審核批準投入到臨床使用。目前迫切的需要對青光眼視神經(jīng)保護進行深入的研究，而神經(jīng)免疫保護是最新提出的防止RGCs進行性喪失的策略之一。在世界范圍內(nèi)，青光眼視神經(jīng)損害的免疫學機制及視神經(jīng)保護的免疫學途徑越來越受到研究者們的關(guān)注，國外的研究認為，由于自身免疫調(diào)節(jié)的紊亂，導致視網(wǎng)膜及視神經(jīng)的某些成分改變而具有抗原性，

2、從而引發(fā)自身免疫反應，導致視網(wǎng)膜及視神經(jīng)損害。 免疫系統(tǒng)在青光眼發(fā)病中所起的作用是雙重的，既有神經(jīng)保護作用亦有神經(jīng)損害作用。更好地了解免疫系統(tǒng)在青光眼視神經(jīng)損傷中的作用，將會幫助我們在青光眼的防治上形成一更好的防治策略。對于青光眼的病人，如何使得保護性免疫與自動免疫引起的神經(jīng)退行性病變損傷相平衡將決定神經(jīng)節(jié)細胞的命運。 CNS通過自身的膠質(zhì)細胞和浸潤至CNS的效應細胞行使免疫防御功能，TLR4是一固有免疫之受體，小膠質(zhì)

3、細胞表達TLRs與其活化狀態(tài)是密切相關(guān)的，能和PAMPs結(jié)合的TLRs在小膠質(zhì)細胞上的表達提供了一個在病原刺激與免疫應答之間關(guān)鍵的聯(lián)系機制，外源的病原體通過與TLRs結(jié)合啟動固有免疫應答進而促進獲得性免疫應答。而TLR4在青光眼視神經(jīng)損傷中的具體作用機制不詳。本課題擬從基因及蛋白水平上研究TLR4和其NF—κB信號轉(zhuǎn)導在小膠質(zhì)細胞活化中的作用及意義，利用免疫組化的方法研究TLR4和小膠質(zhì)細胞在正常大鼠視網(wǎng)膜與慢性高眼壓視網(wǎng)膜上的表達部位

4、與相關(guān)性，并探討TLR4及其NF—κB信號通路在視神經(jīng)損傷中的可能的作用機制。為深入揭示TLR4與小膠質(zhì)細胞的功能關(guān)系，尋找有效的TLR拮抗劑或是阻斷TLR信號通路以實現(xiàn)最佳的小膠質(zhì)細胞活化狀態(tài)，為青光眼視神經(jīng)損傷的免疫治療提供理論依據(jù)。 材料與方法： 1、大鼠慢性高眼壓模型的制備：燒烙3條鞏膜靜脈術(shù)中聯(lián)合絲裂霉素的應用建立大鼠慢性高眼壓模型。TONO-PENⅡ型筆式眼壓計測量術(shù)前，術(shù)后30min、2h、1d、3d、7d

5、、14d、28d、56d眼壓。 2、光鏡下視網(wǎng)膜形態(tài)學的觀察：HE染色，并測量視網(wǎng)膜內(nèi)界膜至外界膜距離即視網(wǎng)膜厚度。 3、模型建立后2h、1d、3d、7d，、4d、28d、56d分別取5只高眼壓組、假手術(shù)組及空白對照組大鼠鼻側(cè)一半視網(wǎng)膜，在視網(wǎng)膜鋪片上行免疫組織化學染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜TLR4、小膠質(zhì)細胞的表達情況。 4、應用RT-PCR法檢測各組視網(wǎng)膜組織中TLR4、小膠質(zhì)細胞的基因mRNA表達

6、及Western—Blot法檢測各組視網(wǎng)膜組織中TLR4、小膠質(zhì)細胞的蛋白質(zhì)的表達，統(tǒng)計結(jié)果均以均數(shù)±標準差表示，多組均數(shù)間的比較用oneway—ANOVA分析，手術(shù)組與空白對照組均數(shù)間的比較用配對t檢驗分析，均用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析。 5、小膠質(zhì)細胞活化模型的建立：在小膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)基上劃痕建立的小膠質(zhì)細胞活化的細胞模型，應用RT-PCR法檢測各組小膠質(zhì)細胞中TLR4、P50、IL—6、TNF-α的基因mRNA表達

7、及Western—Blot法檢測各組視網(wǎng)膜組織中TLR4、P50、IL—6、TNF-α的蛋白質(zhì)的表達，并檢驗封閉NF—κB信號通路后各組視網(wǎng)膜組織中P50、IL—6、TNF-α的蛋白質(zhì)及基因mRNA的表達，統(tǒng)計結(jié)果均以均數(shù)±標準差表示，多組均數(shù)間的比較用oneway—ANOVA分析，劃痕組與對照組均數(shù)間的比較用配對t檢驗分析，均用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析。 結(jié)果： 1、大鼠慢性高眼壓模型眼的術(shù)后各時間點的眼壓與假

8、手術(shù)組及空白對照組的差異具有統(tǒng)計學意義。 2、大鼠慢性高眼壓模型眼的術(shù)后各時間點的光學顯微鏡顯示視網(wǎng)膜厚度經(jīng)歷一由厚變薄的過程。 3、大鼠慢性高眼壓模型眼的術(shù)后各時間點的免疫組化結(jié)果顯示TLR4和小膠質(zhì)細胞在視網(wǎng)膜組織中早期即有表達，術(shù)后7d達高峰。 4、大鼠慢性高眼壓模型眼的術(shù)后各時間點的Western—Blot顯示TLR4和小膠質(zhì)細胞在視網(wǎng)膜組織中早期即有表達，結(jié)果顯示TLR4和小膠質(zhì)細胞在時空上具有相關(guān)性。

9、 5、小膠質(zhì)細胞活化的細胞模型的各實驗組及各時間點的Western—Blot、RT-PCR顯示TLR4、IL—6、TNF-α、P50的蛋白表達組間差異具有統(tǒng)計學意義。 結(jié)論： 1、正常大鼠視網(wǎng)膜組織的色素上皮層可見TLR4的少量表達，并可見靜態(tài)的小膠質(zhì)細胞存在。 2、TLR4在大鼠慢性高眼壓不同時間點的視網(wǎng)膜上的表達，體現(xiàn)了其在大鼠慢性高眼壓視神經(jīng)退行性病變中的免疫調(diào)節(jié)作用。 3、小膠質(zhì)細胞的活化